HPLC同时测定复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱含量共6页

HPLC同时测定复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱含量
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.024
Simultaneous Determination of 6 Aconitum Alkaloids in Compound Tengwu Ointment by HPLC LI Mei-yan1，2， HE Qing-xue1，2， WANG Ai-wu1 （1.Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250021， China；2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）复方藤乌软膏是山东大学附属省立医院骨伤科专家与药学人员遵循
中医药理论共同研制的传统中药制剂，由鸡血藤、生川乌、生草乌、自然铜等组成，具有消肿止痛、续筋接骨等功效，主要用于治疗运动劳损、急性扭伤、挫伤、闪伤及轻度骨折引起的疼痛，临床应用30余年疗效较好。

复方藤乌软膏中的生川乌、生草乌含有乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等乌头类生物碱，既是毒性成分又是有效成分[1]。

我们前期对其制备工艺及皮肤安全性进行了研究[2]。

本研究采用高效液相色谱法（HPLC）建立复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱的含量测定方法，为更好地控制其质量、进一步推广和扩大应用奠定基础。

1 仪器与试药
Waters 600F高效液相色谱仪（Waters2996紫外检测器，Empowers色谱工作站），Agilent XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；CP2250型电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；BSA223S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ-600DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限
公司）。

复方藤乌软膏样品（批号分别为20140508、20140711、20140829），山东大学附属省立医院制剂室制备；乌头碱对照品（批号110720-200410，纯度≥98%）、新乌头碱对照品（批号0799-9403，纯度≥98.3%）、次乌头碱对照品（批号0798-9403，纯度≥98.6%）均购自中国食品药品检定研究院，苯甲酰乌头原碱对照品（批号RFS-B-110305，纯度≥98%）、苯甲酰新乌头原碱对照品（批号RFS-B-100713，纯度≥98%）、苯甲酰次乌头原碱对照品（批号RFS-B-110328，纯度≥98%）均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；乙腈、四氢呋喃为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为乙腈-四氢呋喃（25∶8），流动相B为0.1 mol/L醋酸铵溶液（每1000 mL加冰醋酸0.5 mL），梯度洗脱（0→35 min，17%→25%A；35→60 min，25%A）；检测波长：235 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min。

理论板数按苯甲酰新乌头原碱峰计算应不低于3000。

在此色谱条件下，6种乌头类生物碱均与其他组分能达到较好分离。

色谱图见图1。

3.苯甲酰次乌头原碱；
4.新乌头碱；
5.次乌头碱；
6.乌头碱
图1 复方藤乌软膏中6种乌头类生物碱HPLC图
2.2 对照品溶液的制备
精密称取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱对照品适量，分别置于10 mL容量瓶中，加
入0.05%盐酸-甲醇溶液定容至刻度，制成每毫升含乌头碱0.180 mg、新乌头碱0.180 mg、次乌头碱0.180 mg、苯甲酰乌头原碱0.560 mg、苯甲酰新乌头原碱0.460 mg和苯甲酰次乌头原碱0.195 mg的对照品储备液。

精密量取乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱储备液各2.0、2、0、1.0、1.0、1.2、2.0 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加入0.05%盐酸-甲醇溶液稀释至刻度，制成每毫升含乌头碱36 ?g、新乌头碱36 ?g、次乌头碱32 ?g、苯甲酰乌头原碱56 ?g、苯甲酰新乌头原碱55.2 ?g和苯甲酰次乌头原碱39 ?g的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备
取复方藤乌软膏约10 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液30 mL，超声处理（功率100 W，频率40 kHz，温度25 ℃）30 min，过滤，残渣用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液洗3次，每次10 mL，合并滤液，回收溶剂，残渣用0.05%盐酸-甲醇溶液定容至2 mL，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。

2.4 线性关系考察
分别吸取混合对照品溶液2、6、10、14、18 ?L，按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。

以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，分别进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

2.5 精密度试验
取混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、
苯甲酰次乌头原碱峰面积RSD分别为0.92%、1.27%、1.69%、1.71%、2.12%、2.24%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验
取复方藤乌软膏，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12 h对样品进行测定，记录积分峰面积，结果供试品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱峰面积的RSD分别为1.37%、1.56%、
1.18%、0.94%、
2.17%、1.89%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.7 重复性试验
取同一批复方藤乌软膏，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。

测得样品中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱峰面积的RSD分别为1.75%、2.15%、1.77%、1.41%、1.35%、1.88%，结果表明本方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验
取6份已知含量的复方藤乌软膏，每份约5 g，精密称定，分别精密加入一定浓度的6种乌头类生物碱混合对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表2。

2.9 含量测定
取3批复方藤乌软膏，各约10 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表3。

3 讨论
复方藤乌软膏中，生川乌、生草乌所含的双酯型生物碱（乌头碱、新
乌头碱和次乌头碱）治疗量与中毒量接近，经加工炮制后转化为单酯型生物碱（苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱），毒性大大降低[3]。

目前关于含有乌头碱的中药含量测定报道较多，但同时测定6种生物碱的方法少见。

本研究对乌头碱的提取方法、萃取溶剂和流动相的种类及梯度洗脱条件进行了反复考察和试验，建立了同时测定复方藤乌软膏6种乌头类生物碱含量的方法。

参考乌头类生物碱含量测定的相关报道[4-5]，以6种乌头类生物碱含量为指标，考察了样品中乌头类生物碱的3种提取方法：①氨试液碱化，用乙醚提取后再用0.05 mol/L盐酸萃取，最后用氨水调节pH到10，再用乙醚萃取的碱化酸提法；②用0.05 mol/L盐酸酸化，乙酸乙酯萃取，水层用氨试液调节pH到10，再用乙醚萃取的酸化碱提法；③氨试液碱化，用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）超声提取。

结果发现，法①干扰杂质最少，但提取率相对低，损失较多；法②萃取过程容易乳化，提取率也较低；法③提取率最高，先将样品碱化，使乌头类生物碱游离出来，再用有机溶剂提取的方法干扰少，简便易行，提取效果较好。

对碱化后的萃取溶剂分别以乙醚、异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）进行了考察，结果发现，乙醚作为提取溶剂，回收较为容易、杂质较以异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）为溶剂者少，但提取率低于后者，原因可能为异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液溶解范围大于乙醚，故选择异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液作为提取溶剂。

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1、积金遗于子孙，子孙未必能守；积书于子孙，子孙未必能读。

不如积
阴德于冥冥之中，此乃万世传家之宝训也。

2、积德为产业，强胜于美宅良田。

3、能付出爱心就是福，能消除烦恼就是慧。