细胞培养技术入门
细胞培养技术中的基础知识与操作技巧
细胞培养技术中的基础知识与操作技巧细胞培养技术是现代生物学和医学领域中不可或缺的技术之一。
利用细胞培养技术，我们可以研究细胞生长、发育、分化、疾病等方面的基本问题，也可以应用于药物筛选、细胞治疗、工程组织等领域。
本文将向您介绍一些细胞培养技术中的基础知识和操作技巧。
一、选择培养物在进行细胞培养之前，首先需要选择合适的细胞种类和培养物。
常见的培养物包括DMEM、RPMI1640、MEM等等，不同的培养物适用于不同类型的细胞，具体应该根据细胞种类和实验需求来选择。
此外，培养物中一般也会添加一些重要的成分，如胎牛血清、人血清、靶向蛋白、激素等等，这些成分的含量和种类也会影响细胞的生长与生理状态。
二、细胞培养的基本步骤细胞培养的基本步骤包括细胞的分离、细胞的培养和细胞的观察与分析。
1. 分离细胞分离细胞是细胞培养中的关键步骤之一，通常采用酶消化法和机械法两种方式。
通过酶消化法，可以使细胞与培养皿表面解离，从而得到单个或小团细胞；而机械法则是通过振荡或刮擦来达到分离细胞的目的。
2. 细胞的培养将分离好的细胞加入到预先涂覆有培养物的培养皿中，并将培养皿置于恒温箱（37℃，5% CO2）中培养。
在细胞生长的过程中需要定期更换或添加培养物。
3. 细胞的观察与分析细胞的观察可以通过显微镜来实现，观察细胞形态、大小、数量、移动等生长状态；而细胞的分析则可以利用细胞计数仪、细胞分选仪、PCR等技术，对细胞进行数量统计和功能评估。
三、细胞培养常见问题及应对方法在进行细胞培养的过程中，常会遇到一些问题。
例如，细胞不能够生长或生长缓慢；细胞死亡严重；细胞感染等等。
以下是一些常见问题以及针对问题的解决方法：1. 细胞不能够生长或生长缓慢这种情况可能是培养物失活或者浓度不足，这时候需要更换新鲜的培养物，或者调整培养物的含量。
2. 细胞死亡严重细胞死亡可能是由于细胞抗性引起的，这时候可以根据细胞类型来调整培养条件和细胞密度；另外，也有可能是由于感染、缺氧等过程中引起的，需要及时采取相应的处理措施。
细胞培养技术
细胞培养技术一、细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。
外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可反复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。
体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。
永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特性。
但细胞克隆的细胞系其这一特性可以不明显。
二、细胞培养的环境细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。
因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
2、恒定的温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有也许恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有也许恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复也许；当温度在43℃以上1小时，细胞所有死亡。
3、气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体重要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环，产生供应细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
细胞培养技术入门(共74张PPT)
用品和试剂
培养液、吸管、离心管、培养瓶、CHO/Hela细
胞等。
操作步骤（图）
基础培养基 95％ 发白并出现细针孔空隙时终止消化。
48％（58％）基础培养液。
血清 2％～5％
双抗100u/ml
（13）冻存液：其是配方：
10％DMSO
40％小牛血清（30％FBS） 1％的5.6％NaHCO3
1％双抗
48％（58％）基础培养液。
（14）MEM培养液:其是配方：
63%MEM液 20％的乳蛋白水解物 10％的小牛血清 1％的双抗（P、S）
2.包装：
在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及储 存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装 纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消 毒日期等。
3.消毒:
在组织细胞培养技术中，务必保证组织细 胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污染 可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）和 无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污 染）来完成。
洗净，烘干然后再泡入1％稀盐酸液中30分钟，用自来水彻底冲洗3-5遍，蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸漂洗2遍，烘干备用。
这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。
（胰酶消化分离法、胶原酶法 ）
离心500～ 1000r/min×1～ 2min，
（12）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不 复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。
（11）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的
液体。其是配方：
(5）封好的冻存管即可直接冻存 标准的冻存程序为降温速率﹣l～﹣2℃／min；
二、材料和试剂
基础培养基 ★ 细胞：贴壁细胞株CHO 80％～90％
★ 试剂：0.
利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
细胞培养基础篇
细胞培养基础篇细胞培养基础篇基础篇-无菌操作基本技术1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。
操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。
实验用品以70% ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。
勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。
容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。
对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Class II）。
操作过程中，应避免引起aerosol （气溶胶）之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目：5.1. CO2钢瓶之CO2压力。
5.2. CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
5.3. 无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。
基础篇-实验用品1. 种类：1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。
实验室细胞培养基本知识专题培训课件可编辑全文
PBS的制备
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水； • 放在磁力搅拌器上，设定转速200r/min； • 打开PBS干粉（1L装）加入烧杯中； • 搅拌至完全溶解； • PH计检测PH为7.4，变化＜0.1； • 分装至灭菌的储液瓶中，盖子只轻旋一圈，放入灭菌锅中
湿热灭菌； • 自然冷却后盖紧，4℃或室温保存。
无菌操作技术
无菌操作技术
• 目的：在干净的培养物和含有微生物的外环境之间建立一 个屏障，防止微生物的污染，细菌、支原体、酵母菌、真 菌孢子等。
• 要求：与培养物直接接触的所有材料必须无菌（物品无 菌），培养物和它的非灭菌环境之间不能有直接接触（环 境无菌）。
• 要素：无菌工作区域、良好的个人卫生、无菌试剂和培养 基以及无菌操作。
• 试剂瓶和培养瓶的操作：在洁净台内可以使试剂瓶口敞开 直立，但不能让手或其他物品在开口的容器或无菌吸管的
小结
• 保持一个干净有调理的工作空间，并仅在需要的时候才在 其中工作。
• 尽可能的预先准备好再开始操作，使培养物在培养箱外停 留最短的时间，而且要做到各种操作快速、简便和顺利。
• 保持能看到操作面上的每样东西，时时警惕无菌面和非无 菌面的偶然接触。
• 移液：使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体；每支 吸管只能使用一次，以免交叉污染。使用时方可打开无菌吸管的包装。 吸管应始终位于工作区域内。
• 一般移液操作用移液管和电动移液器，微量移液操作（1ml及以下） 用移液器，一次为多个器皿分装液体用注射器，只有灭菌的部分（移 液管、枪头、 注射器）可以伸进无菌容器内（储液瓶、细胞培养瓶），
果）、经济、规模和机械化；
细胞培养的应用
• 细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术，可为细胞正常生 理和生化 (例如：代谢研究、衰老研究)、药物和毒性化合物对细胞的 作用以及致突变和致癌研究提供上佳的模型系统。细胞培养还可用于 药物筛选和开发以及生物化合物 (例如：疫苗、治疗性蛋白) 的大规模 生产。
《细胞培养基本技术》课件
讨论细胞培养在科学研究和 医学应用中的作用。
细胞培养实验步骤
1
细胞培养器具消毒
2
介绍细胞培养器具的消毒方法。
3
细胞培养
4
将细胞放入培养基中并提供适当的生长条件。
5
细胞准备
从组织样本中提取和准备细胞。
培养基制备
制备适合细胞生长的培养基。
细胞观察与维护
观察细胞生长情况，并进行细胞培养的日常 维护。
细胞培养中常见问题及解决方法
细胞污染
讨论细胞培养中的常见污染源 以及如何预防和解决细胞污染 问题。
细胞死亡
探讨细胞死亡的原因以及如何 识别和解决细胞死亡问题。
细胞特性变异
说明细胞特性变异的原因和影 响，并提供相应的解决方法。
细胞培养的应用领域
医学研究
探讨如何利用细胞培养技术进行疾 病研究和药物筛选。
生物技术
介绍细胞培养在生物技术领域的应 用，如基因工程和重组蛋白制备。
《细胞培养基本技术》 PPT课件
这个PPT课件将会介绍细胞培养的基本技术。通过这个课件，您将了解细胞培 养的背景和目的，并掌握其基本原理和实验步骤。
细胞培养的 细胞培养的重要性
了解细胞所需的培养基成分 和培养条件。
探讨细胞分裂机制以及如何 促进细胞增殖。
组织工程学
讨论细胞培养在组织工程学中的重 要性和应用。
细胞培养中的道德和安全问题
1
动物实验伦理
探讨使用动物细胞进行实验的道德与伦理考
实验室安全
2
量。
介绍细胞培养实验中的安全操作方法和注意
事项。
3
数据和结果处理
讨论研究数据和结果处理的道德和科学性要 求。
总结及未来展望
《细胞培养技术》课件
细胞培养技术是一项重要的生物学技术，通过将细胞生长在适宜的培养基中， 实现细胞的体外培养和繁殖，为研究细胞和开发生物制品提供了重要手段。
什么是细胞培养技术
1 定义
2 历史
细胞培养技术指的是将细胞从生物体中取出， 在适宜的培养基中进行体外培养的技术。
细胞培养技术起源于20世纪初，随着科学技 术的进步，逐渐成为生物学和医学领域的重 要工具。
常用的细胞培养方法
传统细胞培养方法
通过将细胞放置在培养皿中，利用培养基中的营 养物质供养细胞并促进其生长和繁殖。
三维细胞培养技术
通过构建具有三维结构的培养环境，模拟生物体 内的细胞生长环境，促进细胞在体外的功能表达。
动物细胞培养技术
主要应用于医学研究和生物制药领域，常用于人 类或动物细胞的培养和研究。
环保领域
细胞培养技术有助于环境修复和污染物降解，如 污水处理等。
细胞培养技术的挑战和发展趋势
1 挑战
细胞培养技术面临着细胞变异、细胞老化、 污染等问题，需要不断解决和改进。
2 发展趋势
随着科技的不断发展，细胞培养技术将越来 越趋向自动化、高通量和个性化。
结语
1 总结
细胞培养技术是一项重要的生物学技术，推 动了许多领域的发展和进步。
2 展望
未来，细胞培养技术将继续发展，为人类的 健康和社会发展做出更大贡献。
细胞培养基础知识
1 细胞的分类
2 培养基的种类
3 细胞培养条件
细胞可以根据形态、功能、 组织来源等进行分类，不 同类型的细胞需要不同的 培养条件。
培养基可以根据成分和用 途进行分类，常见的有无 血清培养基、无动物成分 培养基等。
细胞的培养需要一定的温 度、湿度、二氧化碳浓度 等环境条件，以及适当的 营养物质供给。
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程细胞培养实验是指将动植物组织或细胞从体内分离并在无菌条件下培养的一种技术手段。
这种技术可以用于研究细胞的生物学特性、疾病的发生机制以及药物的筛选等方面。
以下是细胞培养实验的基本流程和无菌操作的相关知识。
一、细胞培养的基本知识1.细胞培养的种类：常用的细胞培养种类有原代细胞培养、细胞株的维持和传代培养以及细胞系的培养。
2.细胞培养的培养基：细胞培养的培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基。
其中，无血清培养基是通过添加一定的生长因子和营养物质来满足细胞生长的需要，而含血清培养基则是使用含有细胞生长因子和营养物质的胎牛血清来供养细胞。
3.传代培养的液氮保存：为了保持细胞株的可用性，可以将细胞株保存在液氮中，以备将来使用。
4.细胞培养中的无菌操作：细胞培养实验需要在无菌条件下进行操作，以防止细胞污染和外源性菌落的输入。
1.工作台和操作区域的消毒：操作前，需要用75％的酒精或其他合适的消毒剂彻底清洁工作台面、培养箱、玻璃器皿等操作区域。
2.培养器具的消毒：需要对培养器具如离心管、移液枪、显微镜等进行高温高压的无菌处理。
3.培养基的制备和滤过：制备培养基时需要将培养基溶液进行高温高压的杀菌处理，并使用0.22微米的滤膜滤过杂质。
4.无菌技术的掌握：在细胞培养实验中，需要学习和掌握无菌技术，如无菌操作台、细菌灯和无菌手套等的正确使用方法。
5.细胞的分离和悬浮：将组织样本放入消化液中，进行细胞的分离和悬浮，并通过离心和过滤的方式获得单个细胞悬浮液。
6.细胞培养的接种：将细胞悬浮液接种在含有培养基的培养皿或离心管中，放入培养箱中进行培养。
7.细胞传代的操作：当细胞达到一定密度后，需要进行细胞传代操作。
传代操作时，需要将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，并加入新的培养基进行细胞的维持和生长。
总之，细胞培养实验是生物学研究中不可或缺的一项实验技术，掌握细胞培养的基本知识和无菌操作流程对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
细胞培养基本技术PPT课件
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本条件 • 细胞培养的常用技术 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养的注意事项与安全防护
01 细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指将活体组织或细胞 从生物体中分离出来，在模拟体内环 境的条件下，进行培养、繁殖和维持 生命活动的一种技术。
有特定功能的细胞。
细胞克隆技术的优点是能够筛 选出具有特定功能的细胞，缺 点是需要花费大量时间和精力
进行筛选。
细胞融合技术
细胞融合技术是通过将两个或多个细 胞融合成一个新的细胞，用于生产单 克隆抗体、制备杂交瘤细胞等。
细胞融合技术的优点是能够制备出具 有两个或多个细胞特性的杂交瘤细胞， 缺点是需要筛选出具有所需特性的杂 交瘤细胞。
染条件。
04 细胞培养的实验操作
细胞接种与扩大培养
细胞接种
将少量细胞悬液加入培养容器中，轻 轻旋转使细胞均匀分布。
扩大培养
将已生长的细胞从原培养容器中取出 ，按比例加入新鲜培养基，继续培养 。
细胞的观察与检测
细胞形态观察
定期观察细胞形态变化，如生长状态、分裂速度等。
细胞数量与密度检测
使用细胞计数板或流式细胞仪测定细胞数量和密度。
传代细胞培养需要定期进行细胞 分裂和繁殖，以维持细胞的生长
和生产能力。
传代细胞培养的优点是能够大量 生产具有相同特性的细胞，缺点 是细胞的生长和生产能力会随着
传代次数的增加而降低。
细胞克隆技术
细胞克隆技术是通过将单个细 胞培养成一个个独立的群体， 用于筛选具有特定功能的细胞。
细胞克隆技术需要使用适当 的筛选方法来识别和分离具
细胞识别与鉴定
细胞培养基本技术
液，加入23 ml的D- Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞 表面的碎片思考：还有什么作用
加入适量0 1-025％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，
待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液
用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬
果。
•高浓度血清可影响光吸收值;在加入异丙醇溶液或 DMSO前尽量吸净培养液; •吸去培养液时动作要慢,以免吸去形成的结晶。
1 5 细胞冻存和复苏
• Spallanzani 1776最早发表了冷处理对“细胞”生命活动影响的报道; • 1900年前后;科学家基本上肯定了生物成分(如精子)能够在零下温度贮
1/22/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2 半悬浮生长细胞传代（HeLa细胞） • 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使
细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3 贴壁生长细胞传代
• 采用酶消化法传代。常用消化液是025％胰蛋白酶液。
消化法传代培养步骤
贴壁生长细胞传代方法
• 存活测试为利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞
因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。
细胞计数
• 具体操作：
1 将计数板及盖片用75%酒精擦拭干净;并将盖片盖在计数板; 2吸取少许混合均匀的细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满
盖片和计数板之间，静置3 min，注意盖片下不要有气泡，也 不能让悬液流入旁边槽中。 3 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。
• 台盼蓝染细胞时，时间不宜过长约2 min。
活体染色与细胞计数
①将1滴细胞悬液贴壁细胞可经0 25％胰蛋白酶溶液 消化后;吹打制成细胞悬液与2滴台盼蓝液混合后 ，滴入细胞计数板;
第1章细胞培养的基本知识-10页word资料
第一篇细胞工程的基本技术——细胞培养技术第1章细胞培养的基本知识第一节基本概念和名词细胞培养(cell culture)技术即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。
它起源于1885年，德国人Roux用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之存活了数月之久，第一次获得组织块人工培养成功。
1906年，Beebe和Ewing用盖玻片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72小时，并曾见到细胞生长现象。
1907年，Harrison用淋巴液做悬滴培养，使来自两栖类胚胎神经组织的神经细胞存活了若干天，还观察到神经管细胞分化成了神经元，而且向培养液中伸出了轴突，与脑、脊神经细胞在体内分化的情况很类似。
以后Carrel进行了改进，并十分注意培养中的无菌操作技术。
他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，通过采用更新培养基和分离组织的传代措施，完善了经典的悬滴培养法。
1923年，他又设计了用骨化瓶培养法，以扩大组织的生存空间。
50年代，组织培养技术有了更快的发展，从改进培养操作技术、培养器皿和培养基方面进行了改进。
各种培养瓶、培养基孕育而生。
1957年Dulbecco实验室采用胰蛋白酶消化处理，使成块的组织分散成单个细胞，进行悬液培养，从而开创了细胞培养技术。
用单层细胞培养法可以建立很多细胞系(cell line)，通过单细胞分离培养法又可建立克隆细胞株(clone或cell strain)。
细胞系(cell line)系原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
细胞株(cell strain)系通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。
细胞株的这种特定性或标志必须在整个培养期间始终存在。
克隆(clone)系指由同一个祖先细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。
医学研究中泛指的体外培养包括细胞培养、组织培养和器官培养。
细胞培养技术基础流程
细胞培养技术基础流程一、细胞培养前的准备。
咱要做细胞培养呀，那准备工作可不能马虎。
先说说实验室环境吧，得保证干净整洁又无菌。
实验室要经常消毒，紫外线灯可不能少，开着它给屋子来个大消毒，就像给细胞准备一个超级干净的小窝一样。
然后就是各种器材啦。
培养皿、移液枪、离心管这些都是细胞培养的小助手。
在使用之前，得把它们洗得干干净净的，再进行灭菌处理。
这就好比给小助手们洗个澡，再穿上无菌的防护服，这样它们才能好好地为细胞服务呢。
还有培养基，这可是细胞的食物呀。
不同的细胞喜欢不同的培养基，就像咱们人，不同地方的人有不同的口味。
得按照细胞的种类，精心挑选合适的培养基。
培养基里的营养成分就像做菜放的调料一样，要比例合适，这样细胞才能吃得饱、长得好。
二、细胞的获取。
细胞从哪儿来呢？这可就有多种途径啦。
有的细胞是从生物体直接采集的，比如说从动物身上取一些组织。
这个过程可得小心啦，就像从宝贝上小心翼翼地取下一块小碎片一样。
还有些细胞是已经保存好的细胞系，就像从细胞的“小仓库”里拿出来一样。
不管是哪种来源的细胞，在把它们放到培养环境之前，都得进行一些处理。
比如说，从组织里获取的细胞，要先把组织切碎，再用一些特殊的酶把细胞从组织里分离出来，这就像把紧紧抱在一起的小伙伴们轻轻地分开一样。
三、细胞的接种。
四、细胞的培养条件。
细胞在培养的时候，可是很娇贵的，对环境要求很高呢。
温度得控制好，一般来说，大多数细胞喜欢在37摄氏度左右的环境里生长，这个温度就像给细胞盖了一床刚刚好的被子，不冷不热。
除了温度，二氧化碳的浓度也很重要。
合适的二氧化碳浓度就像给细胞提供了新鲜的空气一样。
而且，还要注意培养箱的湿度，太干或者太湿细胞都会不舒服。
这就像咱们人，住在太干燥或者太潮湿的环境里都会觉得难受。
五、细胞的观察和维护。
在细胞培养的过程中，咱们要像照顾小宠物一样照顾它们。
要经常去观察细胞的生长情况。
用显微镜看看细胞的形态呀，有没有什么异常。
如果发现细胞长得不好，或者有污染的迹象，就得赶紧想办法解决。
细胞培养技术的使用教程
细胞培养技术的使用教程细胞培养技术是生物学实验中常用的一项技术，用于研究生物体内细胞的生长、分化、增殖和功能等方面的机制。
本文将为您介绍细胞培养技术的基本原理、操作步骤和注意事项。
一、细胞培养技术的基本原理细胞培养是通过提供适宜的生长环境，使细胞在体外以体内类似的方式生长和繁殖。
细胞培养的基本原理包括以下几个方面：1. 细胞培养基的选择：细胞培养基是提供细胞生长所需的营养物质和生长因子的培养液。
常见的细胞培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等。
根据不同类型细胞的特点，选择合适的培养基十分重要。
2. 细胞培养温度和CO2浓度：大多数细胞在37℃下生长最适宜，同时需要加入5%~10%的CO2，以维持培养基的平衡pH值和细胞的正常生长。
3. 细胞传代和细胞冻存：当细胞达到一定密度时，需要将细胞进行传代，以保持细胞的正常生长。
同时，经过适当处理的细胞还可以进行冻存，以备将来使用。
二、细胞培养的操作步骤下面将为您介绍细胞培养的基本操作步骤：1. 细胞处理：消毒操作台面、工具和培养器具，穿戴好个人防护装备。
2. 细胞离心：将培养皿中的细胞细悬液离心，以去除培养基和代谢产物。
3. 细胞计数：使用显微镜或细胞计数仪对离心后的细胞进行计数。
根据实验需求，计算出所需细胞数目。
4. 接种细胞：将离心后的细胞重新悬浮在培养基中，按照实验要求，平均分装到不同的培养皿中。
5. 细胞培养和观察：将培养皿放入培养箱中，设置合适的培养温度和CO2浓度。
每天观察细胞的生长情况、细胞形态变化和污染情况。
6. 细胞传代：当细胞达到80%~90%的密度时，使用消化酶将细胞从培养皿上脱落，并重新接种到新的培养皿中。
传代细胞时要注意细胞的均一分散和避免过度消化。
7. 细胞冻存：处理好的细胞可进行冻存，将细胞悬液缓慢冷却至-80℃或液氮温度，并存放在液氮罐中保存，以备将来使用。
三、细胞培养的注意事项在进行细胞培养的过程中，有几个需要特别注意的方面：1. 操作环境和消毒：细胞培养需要在无菌环境下进行，操作过程中注意消毒操作台面和使用的工具，以避免细菌和其他微生物的污染。
细胞培养入门教程
细胞培养入门教程细胞培养是生物学中常用的实验技术，它可以通过体外环境来模拟细胞在体内的生长环境，从而研究细胞的生物学性质和功能。
细胞培养具有广泛的应用领域，包括基础科学研究、药物筛选与研发、生物工程等。
本文将介绍细胞培养的入门教程，以帮助初学者掌握细胞培养的基本技能。
一、材料准备进行细胞培养前，首先需要准备以下材料和设备：1.细胞培养基：根据不同细胞类型的需求选择适合的培养基。
培养基种类繁多，常用的有DMEM、RPMI-1640等。
2.培养皿：常用的培养皿有培养瓶、96孔板等。
3.细胞培养试剂：包括胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素/链霉素等。
4.离心机：用于收集和沉淀细胞。
5.培养箱：用于提供细胞培养的合适温度和湿度。
6.显微镜：用于观察细胞的生长情况。
二、细胞传代细胞培养中最基本的操作是细胞传代，也称为细胞分离。
传代的目的是维持细胞的活性和增殖能力，防止细胞过度生长和细胞衰老。
1.预培养：从冷冻保存的细胞种子库中取出细胞，加入预温热的培养基中，使其逐渐适应培养条件。
2.细胞计数：用显微镜和计数板对细胞进行计数，以确定所需的细胞数目。
3.细胞分离：将培养基中的细胞收集并用胰蛋白酶进行消化，使细胞从培养皿上脱落。
4.细胞传代：将细胞分散在新的培养皿中，并加入新的培养基，使细胞继续生长和分裂。
三、培养条件控制为了保证细胞的正常生长和功能表达，需要对培养条件进行严格控制。
1.培养基制备：根据不同细胞类型的需求，添加适量的血清、抗生素等到培养基中。
2.高温高湿：将培养皿放入培养箱中，保持温度在37℃左右，湿度在95%以上。
3.CO2气体：一般培养基中需添加适量的CO2，维持pH值的稳定。
4.培养时间控制：按照不同细胞类型的生长速度和特点，合理控制培养的时间，避免细胞过度生长或衰老。
四、细胞观察与染色细胞培养过程中，需要对细胞的生长情况进行观察和记录。
1.细胞显微镜观察：使用显微镜对细胞进行观察，观察细胞生长情况、形态特征等。
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细胞培养从头学-从最基础的地方教起，一步一步详细介绍细胞培养技术，非常好的开门教程常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
无菌操作无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：一、新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干二、旧的玻璃器皿的洗消：1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。
3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。
（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。
放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。
橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。
注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。
最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。
最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。
塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。
也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。
用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。
其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时__这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。
密写墨水的配制：氯化钻(CoC12·6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。
注意事项：1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。
检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。
B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。
C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。
细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。
具体步骤：一. 水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
四.青、链霉素溶液的配制于消毒1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
2.具体操作均在超净台内完成。
青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。
链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。
1单位＝1微克？五.RPMI1640的制备与消毒：1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。
然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。
最后定容至1000ml，摇匀。
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。
然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。
通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。
六．血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
七.HEPES溶液：HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。
对细胞无毒性作用。
它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。
使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。
过滤除菌，分装后4℃保存。
注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES 的终浓度仍然为20m mol/L 。
如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。
八.谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。
在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。
由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。
加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。