实验六 油菜雄性不育性(株)鉴定选择

实验六油菜雄性不育性（株）鉴定选择
一、目的
学习和初步掌握作物雄性不育系的植物学形态特征和花粉育性鉴定技术。

二、内容说明
作物雄性不育系是指雄性器官发育不正常，无花粉或虽有花粉但不具有受精能力，而雌性器官发育正常，能接受外来正常花粉受精结实。

当前农作物杂种优势利用方法主要有雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢复系三系配套，以及雄性不育系和雄性不育恢复系两系配套。

特点：一个优良的雄性不育系必须具有不育性稳定，且不育株率和不育度都达到100%，农艺性状好，且整齐一致，柱头外露率高，开花习性良好，以利提高制种产量。

在植株形态、花粉育性等方面与正常作物有不同。

作物雄性不育系的鉴定，一般采用植株形态、花粉育性镜检、套袋自交鉴定等方法。

三、实验仪器设备及材料
1.放大镜、显微镜、镊子、酒精灯、载玻片、盖玻片、回形针或大头针、硫酸纸袋、塑料挂牌、吸水纸、铅笔、1%I-KI溶液等；
2.玉米、油菜等植物的雄性不育株和正常株。

四、方法步骤
1.雄性不育系和保持系植株形态特征观察和识别
在不育系繁殖田或杂交制种田对不育系及其保持系（或恢复系）进行逐行逐株观察比较：株型、株高、分蘖、叶色、抽穗开花时间、花药形态、颜色、开裂等情况和开颖角度等形态区别，断定其是否不育系，并选择你认为区分最明显的3-4个性状填入表中，以此证实观察结果。

2.雄性不育系花粉育性镜检鉴定（自学）
当前生产上利用的雄性不育系多属于核质互作的花粉败育类型。

败育花粉经I-KI染色处理，在显微镜下观察，按花粉粒的性状和染色反应分为典型败育、圆形败育和染色败育型。

在镜检过程中，为更准确地鉴定各种类型的花粉，将不育系败育花粉的三种类型和正常花粉的特点列表如下：
雄性不育系败育型花粉与正常可育花粉的比较
（1）取样分别从不育系、保持系（或恢复系）中随机选取即将开花的穗或花序2-4个，挂上标签，带回室内。

从中选择花药已伸长达颖壳（或花蕾）2/3的花朵3—4个，剥开内外颖（或花瓣），从每朵花中取花药3个左右作镜检制片。

（2）制片将花药分别置于载玻片上，用镊子轻轻捣碎，滴上一小滴I-KI溶液染色，去掉药壁后，盖好盖玻片，用吸水纸吸去多余的I-KI，待镜检观察。

（3）镜检将制好的玻片，置于100倍显微镜下仔细观察。

每片各选择有代表性的视野2—3个观察花粉粒的形状和染色反应，正常花粉因有较多淀粉粒，遇I-KI呈紫黑色，不正常花粉则染色浅或不染色。

数计每个视野内不育花粉粒的数量，并计算不育花粉的百分率。

最后根据不育花粉率，判定花粉不育等级。

并将取样观察结果列于表中。

3. 雄性不育系套袋自交结实性鉴定
套袋自交是鉴定育性最准确、最可靠的方法。

即在不育系中选择刚抽穗或尚未开花的花序3个，每穗或花序5朵花，套上羊皮纸袋，用回形针固定让其自交结实。

15天后取掉纸袋，分别统计其自交结实情况。

凡套袋的株（穗）只有一粒结实的就为结实株（穗）。

再计算不育株（穗）率和不育度。

最后根据不育度，确定不育度等级。

将鉴定结果填入表中，并指出其不育株率和不育度等级。

油菜不育系不育度分级标准
复习思考题、作业题：
1.完成表格，并对结果进行分析讨论。

2.还有哪些鉴定花粉活力的方法？其优缺点有哪些？
3.不同农作物雄性不育系最显著的共同特点是什么？
补充知识：
雄性不育的形态差异
雄性不育植株在外部形态上与同品种的正常株极为相似，但是在开花后，不育株与可育株之间可以从雄花的形态上加以区别：
正常植株的花药都是黄色肥大饱满的，内含很多成熟花粉，花粉粒充实饱满，形状大小一致，数量多，在适宜条件下能够充分开裂并将花粉散出。

而不育株的花药则色浅瘦小干瘪，内无花粉或无正常花粉，或花粉粒畸形皱缩不规则，无内容物，在适宜条件下，花药不能开裂，也无花粉散出。

除了以上花药和花粉的差异外，还有一些其它的异常形式，如花丝畸形、花药退化等。

有一些不育基因因与其它基因连锁或一因多效，使一些明显的农艺性状与不育性并存，极有利不育植株的鉴别。

如矮杆籼稻的不育株在抽穗后明显比正常株矮，穗抽不出来，表现有严重的剑叶包裹穗子的现象。

雄性不育的细胞学特征主要反映在花粉败育过程和花药组织结构异常两个方面。

雄性不育的花粉败育特征
被子植物不育系花粉败育的形式和时期是多种多样的。

单子叶植物的花粉败育多数达到或接近双核期。

双子叶植物花粉败育则多在四分体形成以前的时期。

大量研究证明：雄性不育花粉败育的特点因不育的遗传基础不同而不同，其遗传基础的差异决定了花粉败育的形式和时期。

小孢子的形成从花粉母细胞开始，到成熟花粉粒为止，整个过程如下：
⒈花粉母细胞→⒉第一次减数分裂：⑴前期（细线期→偶线期→粗线期→双线期→终变期）⑵→中期Ⅰ→⑶后期Ⅰ→⑷末期Ⅰ→⑸细胞质分裂→⒊第二次减数分裂：⑴前期Ⅱ→⑵中期Ⅱ→⑶后期Ⅱ→⑷末期Ⅱ→⑸细胞质分裂）→⒋四分体→⒌单核期：⑴早期→⑵中期→⑶后期→⒍静止期（间期II）→⒎第一次有丝分裂：（⑴前期→⑵中期→⑶后期→⑷末期）⒏双核期→⒐第二次有丝分裂：（⑴前期→⑵中期→⑶后期→⑷末期→⒑三核期→⒒成熟花粉粒。

一般来说，不育系花粉的败育和退化，大都发生在以下四个时期：小孢子母细胞形成期、小孢子母细胞减数分裂期、单核花粉期、二核和三核期。

其中前两个时期败育的较少，通常都是在花粉发育时期败育的，尤其以单核花粉期的败育最为普遍。

根据败育时期和形成结构可将花粉败育划分为三种类型。

1、无花粉型从造孢细胞到花粉母细胞减数分裂形成四分体以前的各个时期，由于细胞进行无丝分裂，原生质块状解体，异形细胞不断分裂成小细胞后消失，四分孢子体保持收缩状态，细胞解体成碎片状最后导致花粉囊中无花粉。

2、单核败育型通过减数分裂形成的四分体进一步发育形成花粉粒，刚形成的花粉粒是一个单核的细胞，在单核花粉晚期败育的称为单核败育型，它的原生质收缩，核膜消失，核物质与胞质相混逐步解体消失，内容物空缺，变成空壳花粉或胞壁崩缺退化，花粉囊中最后只剩下各种畸形的花粉粒。

3、双核败育型花粉发育进入双核以后至花粉发育成正常花粉以前败育的称为双核败育型，这时生殖核和营养核逐步解体消失，多成空壳花粉，有些二核期后，生殖核和核仁变小，营养核退化，核膜消失，花粉充满小液泡，甚至有少量淀粉积累，最后在花粉囊中残存一些与正常花粉有别的空壳或小粒花粉。

花粉败育是一个连续过程，与细胞质和细胞核都有关，有些不育系可能只表现在同一时期败育的一种花粉败育型，但有些不育系则可能同时存在不同时期败育的多种花粉败育型。

一般规律显示，孢子体不育遗传型的花粉败育相对较早，多为单核败育型，而配子体不育的花粉败育相对较迟，多为双核型。

以电子显微镜研究玉米、小麦、水稻等作物的花粉败育特征，其结果有一些共同之处，都表现不育花粉比可育花粉的细胞质稀薄，细胞器较少，质体膨胀；线粒体基质发亮，嵴短而少，逐步退化；内质网不发达，核糖体多为聚核糖体，液泡增多等现象。

液泡膜内陷而破坏。

水解酶功能活跃。

超微结构逐步退化解体，导致花粉的败育。

雄性不育花药壁的异常结构
1、绒毡层细胞的异常现象
2、中间层细胞的异常现象
3、花药壁结构的异常及其它
三、雄性不育的生理生化特性
雄性不育系与可育系在生理生化特性上也存在一些不同。

总的来说，不育系的生理代谢水平要比可育系低，在这方面的研究涉及物质和能量的代谢、蛋白质、酶、激素的变化等方面。

（一）物质运输和代谢
（二）能量代谢
（三）蛋白质
1、蛋白质代谢强度的差异
2、植物特异蛋白与雄性不育
（四）氨基酸含量
1、总量
2、氨基酸的变异性
（五）酶的活性
1、胼胝酶
2、细胞色素氧化酶
3、脱氢酶
4、葡萄糖—6—磷酸脱氢酶
5、磷酸化酶
6、其它酶
7、酶的差异
（六）内源激素
核酸缺乏、微量元素的缺乏
雄性不育性的花药中，核酸含量的减少，可能归因于酶系统以及核酸合成所需的核苷酸或先驱物的功能不全；大部分雄性不育花药中显示出紊乱的氮—碳代谢，糖、核酸和氨基酸的含量的变化以及酶的活性降低，这些变化并不是雄性不育性基因作用的原因，而是其结果。