菠萝蛋白酶的制备和提取
菠萝蛋白酶分离方法(精)
• 工艺流程如图 所示。超滤法生产工艺和操作比较 复杂，且设备一次性投资大。超滤浓缩后的浓缩 液若再用高岭土吸附法或者单宁沉淀法提取，可 大大节约其他辅助原料的用量，总生产成本减少， 且产品质量好，纯度高，酶活力高，酶活总回收 率高，经济效益明显比传统工艺好。超滤浓缩后 的浓缩液用有机溶剂沉淀法提取精酶，由于需要 低温使生产成本上升，但产品质量、纯度、酶活 都优于前者，是菠萝蛋白酶升级换代的新工艺。
菠萝蛋白酶制备方法及比较
工业生产上对菠萝蛋白酶的制备主要是从菠萝的 下脚料中提取，制备工艺有高岭土吸附法、单宁 沉淀法、盐析法和超滤法等。
• 比较:高岭土吸附法获得的菠萝蛋白酶虽然纯度较高， 酶活力在410×10 U／g以上，但工艺流程长，原料消 耗多，酶活总回收率低，会对环境有污染； • 单宁沉淀法比高岭土法简单，原料消耗少，酶活回收 率较低，产品酶活力在315×10 －410×10 U／g，会 对环境造成污染； • 盐析法获得的菠萝蛋白酶活性较低，纯度与药用要求 相差甚远
• 超滤法能有效分离提取菠萝蛋白酶。从超滤法提 取菠萝蛋白酶的工艺流程上看，其操作步骤简单， 并且该法具有无相变、低温、能耗少、活力损失 小、操作简单等特点，应用于菠萝蛋白酶的浓缩 和分离，不仅能保护其活性，降低生产成本，使 用的有机溶剂可回收再生产，基本上没有废物排 放，而且超滤透过液还可用作饮料添加剂，可以 达到清洁生产的要求；另外，超滤法分离得到的 菠萝蛋白酶质量好，纯度高，能达到医药级水平。
菠萝蛋白酶的提取：称取1 kg制备好的鲜果 皮汁，加5％苯甲酸钠溶液10 ml搅匀，以4 000 r ／min离心7 min，取上清液倒人干净烧杯中。上 清液分装在6个小烧杯中，每个装100 ml菠萝汁， 分别缓缓加入空白、0．1％、0．2％、0．3％、 0．4％、0．6％单宁溶液10 ml，边加边拌约1 5min，沉淀物析出，静止40 min。虹吸除去上清 废液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r ／min。离心5 min，倒掉上清废液，得到酶糊复 合物。分离、洗涤和保护把提取的蛋白酶糊倒人 烧杯中，加0．1％EDTA溶液100 ml搅匀，再将 1．5％氯化钠溶液200 ml倒人烧杯中搅匀，以
从菠萝中提取菠萝
3、实验过程中酸碱调节应准确，准确度越高，提取酶 的浓度越高。
4、盐析尽量完全，否则提取酶中杂质较多。
问题建议
此次试验涉及到哪些已学知识？
1、固相析出分离技术—盐析
2、吸附分离技术
3、离心技术操作
4、浓缩及成品干燥
目录
相关背景知识 实验目的 实验原理 实验仪器与药品 实验步骤 工艺流程 结果处理及分析 注意事项 问题建议
相关背景知识
菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实 、芽、叶、茎中， 从菠萝的果实中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝的茎 中提取的称为茎菠萝蛋白酶。菠萝蛋白酶的分子量为 33000,等电点9.55，为浅黄色无定形粉末，微有特异臭, 是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋 白 质，肽，酯 ，酰 胺。它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性 高十倍 以上，因此有着广泛的用途，可作为一种食品添加剂 。
将汁液移人吸附槽中搅拌同时加入的高岭土搅拌约20min在10吸附3060min用虹吸排掉上清液收集高岭土吸附物l6的naoh溶液调节吸附物的ph值至70左右再加入质量分数为79的食盐水搅拌30min进行洗脱然后迅速抽滤收集滤液
高岭土吸附法 从菠萝中提取菠萝蛋白酶
制药09303 二组 组员：王晓雄、倪文芳、杨盼、吴东升、 徐小风、吴登峰
实验原理
将高岭土吸附剂经过预先洗涤与活化.然后在低 盐,弱酸性或接近中性条件下加样吸附,吸附后可直 接用食盐水洗除杂质.再在弱碱条件下进行洗脱. 可 以提高离子强度进行洗脱,在上述洗脱剂中加入 10%—25%的硫酸铵。洗脱液体积不应超过吸附剂的 体积.洗脱方式一般采用静态法,先加入少量的吸附 剂,以吸附除去部分杂蛋白, 若以柱层析法进行,由 于吸附颗粒较小,流速慢,吸附剂粘度大，故用吸附 槽进行吸附洗脱。
菠萝蛋白酶
菠萝蛋白酶的应用
三、菠萝蛋白酶的应用前景
菠萝蛋白酶的应用已有很长的历史,其安全性已受 到时间的考验,对当前危害人类健康的疾病,如心血管疾 病、癌症等,菠萝蛋白酶已表现出其应用潜力。值得一 提的是,菠萝蛋白酶制品大多数是各种成分的混合物,而 且,其组成会因不同的品种、产地及提取方法而产生一 定的差异,因此,有必要进一步确定真正起作用的具体成 份,选择适当的提取工艺,得到专一性更强的药物。此 外,菠萝蛋白酶作为生物活性物质,易受有关因素的影响 而失活,如何在生产、储存、运输中保存所需酶的活 性,如何提高菠萝蛋白酶的生物利用度,这些都是需要进 一步研究的课题。
菠萝蛋白酶的应用
一些含菠萝蛋白酶的药物
菠萝蛋白酶的应用
二、菠萝蛋白酶在食品领域的应用
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂, 能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等, 可用于肉质嫩化、 水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。菠萝蛋白酶对 含酪氨酸较多的蛋白质有很强的水解能力, 用于牛肉 加工中的嫩化过程, 抑制血小板聚集,加速纤维蛋白原的分解 菠萝蛋白酶能抑制血小板聚集引起的心脏病发 作和中风,缓解心绞痛症状,缓和动脉收缩,加速纤维 蛋白原的分解。因此,它作为蛋白水解酶对心血管疾 病的防治也是有益的。Metzig等(1999)研究结果表 明,菠萝蛋白酶在体外可以减少人体血小板聚集,减 少血小板在牛内皮细胞的吸附和大鼠体内血栓的形 成。这些结果解释了临床上使用菠萝蛋白酶治疗血 栓及相关疾病的效果。
菠萝蛋白酶常见的工业提取方法
3.超滤法浓缩有机溶剂提取 工艺流程：
菠萝蛋白酶常见的工业提取方法
超滤法浓缩有机溶剂提取生产工艺和操作比上述 两种方法复杂,超滤膜的使用、清洗、保护操作技术 含量高,对工人素质要求高;设备一次性投资大, 生产 成本上升。但超滤透过液可作饮料添加剂,有机溶剂 可回收再生产,基本上没有废物排放,可以达到清洁生 产的要求;加上酶质量好、纯度高、回收率高、产品 酶活力高,达到医药级,综合经济效益分析与高岭土吸 附法相当,但酶质量远优于后者。
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3
菠萝蛋白酶的制备及其活力测定
1、防腐剂：5%苯甲酸钠溶液：取5g苯甲酸钠加蒸馏水至100ml，混匀，即得。
2、沉淀剂：0.2%鞣酸溶液：取鞣酸0.6g，加乙醇至300ml，溶解混匀，即得。
3、洗涤剂Ⅰ：0.1%EDTA用0.5%的EDTA稀释即得。
1.5%Na Cl ：取Na Cl 12g ，加纯水至800ml，混匀，即得。
4、洗涤剂Ⅱ：0.5%乙酸锌：取乙酸锌2.5g，加水至500ml，混匀，即得。
0.06%抗坏血酸：取抗坏血酸0.12g，加水至200ml，混匀，即得。
0.5%EDTA：取EDTA1.5g，加水至300ml，混匀，即得。
5、洗涤剂Ⅲ：0.5%硫代硫酸钠：取硫代硫酸钠0.5g，加水至100ml，混匀，即得。
0.1% L-半胱氨酸溶液10ml【配制方法：取L-半胱氨酸0.1g,加水10ml,加1mol/L 盐酸溶液(浓盐酸1ml加水至12ml即得)6～8滴，最后用6mol/L的氢氧化钠试液（240g氢氧化钠加水至1000ml即得）中和至pH3～4。
】扩大10倍体积。
6、菠萝蛋白酶活力测定试剂：（此试剂暂不配制，看提取情况再定）0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0):取6.8g磷酸二氢钾(136.09g/mol)加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，即得。
激活剂【取6.8g磷酸二氢钾加水至1000ml，用0.2M氢氧化钠试液调pH7.0，加15mol的硫代硫酸钠(158g/mol)，加6molEDTA-2Na(374.26g/mol),现用现配。
】1%酪蛋白：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml烧杯中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，转移至100ml容量瓶内定容，保存于冰箱内。
1mol/L氢氧化钠：去氢氧化钠40g加水至1000ml，即得。
也可以用6mol的稀释。
器材：榨汁机、离心机(本实验室的那太不好用，申请调换)、冰箱、干燥器、研钵、剪刀、紫外分光光度计。
菠萝蛋白酶
四、前景
菠萝蛋白酶的应用已有很长的历史，随着 提取纯化技术的进步，它将有更广泛的应用。 我国菠萝资源丰富，年产菠萝100万吨以上， 每年都有大量的菠萝皮、茎被浪费掉。同时， 我同对菠萝蛋白酶的需求量逐年增多，特别是 高活性的菠萝蛋白酶。因而，对菠萝蛋白酶分 离纯化技术进行深入研究，提取高质量的菠萝 蛋白酶具有重要的实用价值。
三、菠萝蛋白酶在食品加工中的 应用
肉类：菠萝蛋白酶将肉类蛋白质的大 分子蛋白质水解为易吸收的小分子氨 基酸和蛋白质，令肌肉肌丝和筋腰丝 断裂，使肉类变得嫩滑，使人体食用 后易于消化吸收,可广泛地应用于肉制 品的精加工。
酸豆乳:利用菠萝蛋白酶的蛋白水解活 性，将豆乳中的蛋白质部分水解成为 功能性多肽，再添加发酵剂制成酸豆 乳。顾仁勇等采用正交实验法，以蛋 白质水解度为评价指标，确定最佳酶 解条件为：菠萝汁用量15％；pH=7.0； 温度45℃；时间70min。
2.菠萝蛋白酶的理化性质
菠萝蛋白酶的分子量为30000～33000，酶液 的最大吸收波长为280nm，0.051%浓度的酶液 在280nm的光吸收值达0.984%。分子中有4个 N-乙酰化的氨基己糖，含糖 2.1%，分子中含 有285个氨基酸残基，含氮量为15.88%。 一般认为，菠萝蛋白酶无毒、无副作用，少 数人会对菠萝蛋白酶起过敏反应及轻微的肠胃 反应。
溶解：将粗酶放入溶解罐中，加入10倍水。用 NaOH溶液调pH值至7.0～7.5，搅拌使其溶解， 过滤除杂，收集滤液。 沉淀、干燥：在搅拌下用1:3的盐酸凋节上述 滤液的pH值至4.0，静置1小时使酶析出，用离 心机分离出沉淀物，冷冻真空干燥或减压干燥 即得菠萝蛋白酶精品。
2、单宁沉淀法
菠萝蛋白酶的提取分离纯化及活性测定
菠萝蛋白酶得提取、初步分离纯化及活性测定１5食安(1)班张凯摘要:本研究运用硫酸铵沉淀法与透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量,得到同一品种及成熟度得菠萝皮经两种不同得纯化方法处理,菠萝皮中得蛋白酶都能被有效纯化,但就是蛋白酶活性会损失一部分、关键词:菠萝蛋白酶;透析法;分离纯化;酶活性;前言菠萝蛋白酶(bromelａｉｎ)就是从菠萝植株中提取得一类蛋白水解酶得总称,主要存在于菠萝茎与果实中,根据提取部位得不同,分为茎菠萝蛋白酶与果菠萝蛋白酶。
Mａrcaｎo于18９1年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶、随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药与化工领域有很好得利用价值。
1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。
目前,菠萝蛋白酶得一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域、随着提取纯化技术得不断进步,高活性得菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工与食品领域。
[１］利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶,不仅可充分利用资源,拓展菠萝蛋白酶得获取途径与应用空间,还可降低菠萝加工废料对环境得污染;随着市场对菠萝加工产品需求量得增大,对于菠萝皮得研究与利用就显得尤为重要,尤其对最主要得功能成分蛋白酶得分离、纯化与性质得研究更有意义、[２]本文通过对菠萝皮蛋白酶得提取,初步分离纯化及活性测定进行了初步研究,探讨影响菠萝蛋白酶活性得影响因素,并解决实验存在得一些问题、1实验材料与仪器１、1实验材料与试剂新鲜菠萝,透析袋(截留相对分子质量８00０~１４０00),0。
１mo1／ＬpH 7.8磷酸缓冲液配制(ＰBS),0.0１mｏ1/L pH 7。
８磷酸缓冲液配制(PBS),1%酪蛋白,激活剂[含20mｍo1/L半胱氨酸-盐酸盐、1mｍo１/L EDTA—Na2(乙二胺四乙酸二钠)],10%三氯乙酸(TCＡ)。
1、2实验仪器７2２型可见光分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司;７52型光栅分光光度计:北京光学仪器厂;TＤL－６0B台式离心机:上海安宁科学仪器厂;D5Ｍ离心机:长沙湘智离心机仪器有限公司;DK-８Ｄ电热恒温水浴锅:上海森信实验仪器有限公司;可控硅恒温水浴锅:上海锦屏仪器仪表有限公司;AMPUT电子天平:深圳安普特科技有限公司;BS１１０S分析天平北京赛多利斯天平有限公司;ＤS—１型高速组织捣碎机:上海标本模型厂;HZS-H型水浴振荡器:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
菠萝蛋白酶的提取与活力测定
上清液 沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液
4200r/min,5min离心
氯 化 钠 溶
酶复合物 10
在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0. 2 %沉淀蛋白的效果最好,同时 果汁的总酸度不大,糖酸比合适,菠萝汁中菠萝蛋白酶的沉淀率达到72%。菠萝蛋 白酶提取时,pH值为6. 5～8.5左右,温度为6 0℃,菠萝蛋白酶的活性最强 ,可作为最 佳提取条件。
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计算酶的比活性 • 酶的比活性 • （F.I.P.-U/mg)=E275/(Ew×0.116×10） • E275——275nm处得吸光度 • Ew——每2.5ml所用酶液中含酶的重量，mg • 0.116——275nm处酪氨酸溶液（1umol酪氨酸/10ml）的吸光度 • 10——反应时间，min
•
温度范围： 50～60℃
•
作用PH值: 6.0～9.0
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三、实验材料和试剂 1、实验材料
新鲜菠萝(下脚料）、0.1mg/ml牛血清蛋白 2、实验试剂 柠檬酸钠 维生素C 单宁 0.1%EDTA溶液 1.5%氯化钠溶液 1%酪蛋白溶液 1mol/L氢氧化钠溶液 0.05mol/L磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调PH至7.0） 激活剂（PH7.0，0.05mol/L磷酸缓冲液，内含15mmol/L硫代硫酸钠和6mmol/LEDTA2Na,现配现用）
工艺流程： 菠萝下脚料→压榨→汁液→去杂质→澄清液→超滤浓缩→浓缩液→降温→加有机溶
剂沉淀（ 95%乙醇）→湿酶→减压干燥→酶制品
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二、菠萝蛋白酶在医药、保健品
• 1、抑制肿瘤细胞的生长 • 2、对心血管疾病的防治 • 3、用于烧伤脱痂 • 4、消炎作用
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菠萝蛋白酶的制备和提取
（一）原料及试剂
1.菠萝皮加工菠萝削下的新鲜菠萝皮。
2.氯化钠见“凝血酶的提取”。
这里用作配制浸泡液，选用化学纯试剂。
3.苯甲酸钠见“绒膜促性激素的提取”。
这里用作防腐剂，选用化学纯试剂。
4.高岭土见“人尿促性腺激素的提取”。
这里用作吸附剂，选用化学纯品。
5.氢氧化钠见“血红素的制备”。
用于调节PH值，选用化学纯试剂。
6.硫酸铵见“胸腺素的提取”。
选用工业级试剂。
7.盐酸见“血红素的制备”。
这里用于调节PH值，选用化学纯试剂。
8.柠檬酸见“胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的提取”。
这里用于调节PH值，选用化学纯试剂。
9.抗坏血酸又称维生素C。
这里用作稳定剂，选用化学纯试剂。
10.二氧化硫又名亚硫酸酐。
密度2.92克/升（气）、1.43克/厘米3（液），熔点-76.1℃，沸点-10℃，一种无色而有刺激气味的有害气体。
这里用作稳定剂，选用工业级试剂。
11.EDTA-2Na全称为乙二胺四乙酸二钠盐，这里用作稳定剂，选用化学纯试剂。
12.鞣酸见“血红素的制备”。
这里用作吸附剂，选用化学纯试剂。
（二）提取工艺
1.用高岭土吸附制备
（1）工艺流程
菠萝皮→（压榨）→汁液→（吸附）→吸附物→（洗脱）→洗脱液→（盐析）→盐析物→湿粗品→（溶解）→澄清液→（沉淀）→沉淀→（干燥）→精品
（2）操作步骤
a.压榨：把加工后的菠萝皮洗净用压榨机压出汁液，然后按汁液体积加入0. 05%的苯甲酸钠（防腐剂），置4℃冰箱或冷库中保存备用。
b.吸附：将汁液移入搪瓷缸中，搅拌下加入4%的白陶土（又称高岭土），在10℃汁液吸附30分钟，然后静置过夜。
次日吸去上层清液，收集下层白陶土吸附物。
c.洗脱：在上述白陶土吸附物中加入7%氢氧化钠溶液，调节PH值至7.0汁液，再加入吸附物重50%的硫酸铵粉末，搅拌40分钟进行洗脱，然后压滤，弃去杂物，收集滤液。
e.盐析：将压滤液收集到搪瓷桶中，用1：3的盐酸（即1份浓盐加3份水），调节PH值至5.0左右，搅拌下加入压滤液重25%的硫酸铵粉末，待硫酸铵完全溶解后，置4℃过夜，于离心机上分出上层清液，收集下层盐析物，得粗品。
f.溶解：将粗品放入另一搪瓷桶中，加入10倍量的自来水，用16%的氢氧化钠溶液调节PH值至7.0～7.5，搅拌使其溶解，然后过滤，除去杂质，收集滤液。
g.沉淀、干燥：在搅拌下用1：3的盐酸调节上述滤液的PH值至4.0，然后静置使酶析出，于离心机上分出沉淀物，弃去离心液，沉淀冷冻干燥即得菠萝酶精品。
2.用鞣酸吸附制备
（1）工艺流程
菠萝茎（去皮）→（压榨）→汁液→（去杂质）→澄清液→（稳定）→稳定液→（沉淀）→鞣酸沉淀物→（洗脱）→滤液→（干燥）→产品
（2）操作步骤
a.压榨：取菠萝去皮，收集菠萝茎，切成小块用压榨机压出汁液。
b.去杂质：将汁液移入搪瓷缸中，搅拌下加入汁液重10%的固体氯化钠，然后置10℃条件下放13小时汁液，过滤分出滤液。
残渣加入等量水后，用柠檬酸调节PH值至4.5汁液（先加10%固体氯化钠），搅拌均匀，浸泡40分钟，过滤分离出滤液（合并二次滤液）。
c.沉淀：将澄清液移入搪瓷桶中，在搅拌条件下，按澄清液体积加入0.05% EDTA-2Na、0.06%的二氧化硫、0.02%的维生素C（作稳定剂）及0.6%左右的鞣酸，放置4℃条件下静置，于离心机上分出沉淀物，弃去上清液。
e.洗脱、干燥：将沉淀物放入搪瓷桶中，加入2～3倍量PH值4.5的抗坏血酸溶液，搅拌洗脱40分钟，然后过滤，收集滤液，减压干燥，即得菠萝蛋白酶精品
（三）设备
压榨机 1台搪瓷缸 2口
搪瓷桶 2只
离心机 1台
温度计（0～100℃） 1支
酸度计（或PH试纸） 1台
干燥器 1个
烧杯（2000毫升） 2只
量筒（1000毫升） 2只
搅拌机 1台。