人滋养层细胞表面抗原2在人胰腺癌中的表达及其临床意义

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医院普外科住院手术的胰腺癌患者；人胰腺癌ＢｘＰｃ３细胞系购于中国科学院细胞库；人胰腺癌组织芯片购于上海芯超生物科技有限公司，片载３ｌ例胰腺癌组织及相应癌旁组织共６２点，临床资料包括年龄、性别，按ＷＨＯ消化系统肿瘤分册２０００年分类标准一Ｊ，其中高分化腺癌８例、低分化腺癌２３例。Ｔｒｉｚｉｏｌ试剂购于美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，ＲＴ—ＰＣＲ试剂盒购于日本ＴａｋａＲａ公司，羊抗人Ｔｒｏｐ－２多克隆抗体购于德国Ｒ＆Ｄ公司，罗丹明标记的驴抗羊抗体购于美国Ｓｉｇｍａ公司，化学染核试剂ＤＡＰＩ购于日本Ｄｏｊｉｎｄｏ公司，免疫组化ＳＰ试剂盒购于福州迈新生物技术有限公司。

二、方法

１．人胰腺癌组织中Ｔｒｏｐ－２的ＲＴ－ＰＣＲ检测：引物设计按照ＧｅｎＢａｎｋ提供的序号为ＮＭ＿００２３５３的Ｔｒｏｐ－２ｍＲＮＡ序列和编号，使用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计，Ｏｌｉｇｏ６．０软件进行评价筛选，引物合成由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司完成。Ｔｒｏｐ－２上游引物：５’ＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧＧＡＣＡＡＣ’Ｉ’ＧＣ３’，下游弓ｌ物：５’ＧＧＴＧＡＧＧＣＧＣＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＡＣＴＴＣＧ３’，预期目的片段大小为７６４ｂｐ。

用Ｔｒｉｚｏｌ法提取８例胰腺癌组织中总ＲＮＡ，溶解于经ＤＥＰＣ处理的无ＲＮＡ酶水中。一８０℃保存备用。逆转录及ＰＣＲ扩增，根据试剂盒使用说明书进行。

２．免疫荧光检测：将胰腺癌细胞ＢｘＰｃ３培养于细胞培养室中，固定后用封闭液室温封闭３０ｍｉｎ，加入羊抗人Ｔｒｏｐ－２抗体，３７℃孵育１ｈ；加入Ｒｈｏｄｅｍｉｎｅ标记的羊ｌｇＧ抗体为二抗，３７℃孵育ｌｈ，ＰＢＳ洗涤后用ＤＡＰＩ染色，ＬｅｉｃａＴＣＳＮＴ激光共聚焦显微镜分析。

３．免疫组化分析：免疫组化染色步骤采用ＳＰ法，羊抗人Ｔｒｏｐ－２多克隆抗体为一抗，用自身对照作阳性对照，用ＰＢＳ代替一抗作阴性对照。

结果判定方法旧Ｊ：在高倍镜下观察，根据染色阳性肿瘤细胞数目所占百分比计分，阴性为０分，阳性细胞数占ｌ％一１０％计１分，阳性细胞数＞１０％～５０％计２分，阳性细胞数＞５０％计３分；染色强度按肿瘤细胞着色的深浅计分：无着色为０分，黄色为弱阳性计１分，浅棕色为中等阳性计２分，棕褐色为强阳性计３分；两项之积：Ｏ分为（一），ｌ～３分为（＋），４—６分为（＋＋），９分为（＋＋＋），４分以上为高表达。

三、统计学方法

采用ＳＴＡＴＡ９．０统计学软件进行分析，用Ｗｉｌｃｏｘｏｎ秩和检验分析免疫组化结果和Ｉ临床病理特征之间关系，以Ｐ＜Ｏ．０５为差异有统计学意义。

结果

一、人胰腺癌组织中Ｔｒｏｐ－２基因的ＲＴ—ＰＣＲ检测

８例胰腺癌组织中ＲＴ—ＰＣＲ检测到Ｔｒｏｐ－２ｍＲＮＡ，其中７例扩增出预期大小的Ｔｒｏｐ－２ｅＤＮＡ片段，约为７６４ｂｐ（图１），１例未见明显条带，阴性对照无条带。

注：Ｍ．ＤＮＡ标准参照物；１．阴性对照；２－９．胰腺癌组织图１８例人胰腺癌组织中Ｔｒｏｐ－２的ＲＴ－ＰＣＲ扩增

二、胰腺癌细胞膜Ｔｒｏｐ－２蛋白的免疫荧光检测

免疫荧光结果示，抗Ｔｒｏｐ一２抗体可以与人胰腺癌细胞系ＢｘＰｅ３特异性结合，阳性信号主要存在于细胞膜上（图２）。

田２胰腺癌细胞ＢｘＰｅ３的免疫荧光检测；九抗Ｔｒｏｐ－２抗

体阳性信号；Ｂ．普通显微镜下的ＢｘＰｅ３细胞；ｃ见ＢｘＰｅ３

细胞核；Ｄ．阳性信号存在于细胞膜上。核中无信号

三、组织芯片和免疫组化分析

１．组织芯片的免疫组化检测（图３）：镜下检测

发现，Ｔｒｏｐ－２阳性表达主要定位于人胰腺癌细胞的

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细胞膜上（图４），本组表达率高，为８７．１％；癌旁组织中Ｔｒｏｐ－２阳性表达定位于胰腺腺泡上皮细胞的细胞膜上，本组表达率为９．７％；肿瘤间质及大部分癌旁胰腺组织中无阳性信号（图４）。肿瘤分类及Ｔｒｏｐ一２表达的统计分析结果（表１）表明，Ｔｒｏｐ－２在胰腺癌组织中表达强度明显高于其在癌旁组织。

圈３组织芯片的免疫组化检测

圈４Ｔｒｏｐ－２在胰腺癌组织及癌旁胰腺组织中的表达：镜下

组织芯片免疫组化染色（ＳＰ法）（Ａ、ＢＸ４０。Ｃ：癌旁组织

ｘ２００。Ｄ；胰腺癌组织Ｘ４００）

表１胰腺癌及其癌旁组织中Ｔｒｏｐ－２的表达（例数）

２．胰腺癌中Ｔｒｏｐ－２的表达与临床病理特征的关系：根据芯片公司提供的数据，结合免疫组化结果分析，结果显示。Ｔｒｏｐ－２在胰腺癌组织中的表达与年龄、性别方面均无明显相关。但与胰腺癌的分化程度

呈明显的负相关（表２）。

表２胰腺癌中Ｔｒｏｐ－２的表达与临床病理特征的关系（例数）

讨论

早在１９８１年，Ｌｉｐｉｎｓｋｉ等［９１用多种单克隆抗体研究正常人体和癌变的滋养层细胞时，发现了四种表面抗原，分别命名为Ｔｒｏｐ．１，２，３，４。其中Ｔｒｏｐ．１和Ｔｒｏｐ－２在正常人体合胞体滋养层和细胞滋养层以及复层上皮细胞特异性表达，在正常人体细胞中不表达或很少表达，但在肿瘤细胞中高表达，是一种肿瘤相关抗原。Ｔｒｏｐ－２是一种单体跨膜糖蛋白，由３２３个氨基酸构成，其中信号肽２６个氨基酸，胞外区２４８个氨基酸，跨膜区２３个氨基酸，胞质尾区２６个氨基酸。Ｔｒｏｐ－２的相对分子质量大约为３５０００，由染色体１ｐ３２－ｐ３２或者ｌｐ３１一ｑ１２上的ＴＡＣＳＴＤ２基因编码¨０。挖Ｊ。在２００７年西班牙巴塞罗纳召开的欧洲癌症大会上，意大利科学家ＳａｖｅｒｉｏＡｌｂｅｒｔｉ表示，他们分析了许多种肿瘤，最后发现其中６５％～９０％癌症内都含有的Ｔｒｏｐ－２。研究表明，Ｔｒｏｐ－２表达与多种消化系统、女性生殖系统的恶性肿瘤的发生发展、淋巴结转移甚至预后有关口引。

本研究８例人胰腺癌组织中，７例有Ｔｒｏｐ－２ｍＲＮＡ表达，免疫荧光结果示胰腺癌ＢｘＰｃ３细胞系的细胞膜上有Ｔｒｏｐ·２的表达，证实Ｔｒｏｐ－２在胰腺癌中有表达，而且是一种膜蛋白。

组织芯片技术是２０世纪９０年代末期兴起的一种特殊的生物芯片技术，组织芯片可将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本排列在一张玻片进行分析研究，是一个高通量、多样本的分析工具；可同时对几百甚至上千种正常或疾病以及疾病发展不同阶段的组织样本，进行某一个或多个特定的基因的研究；该技术也可与传统且经典的免疫组化技术相结合，在基因蛋白表达水平上进行研究【２’ｂＪ。为了解Ｔｒｏｐ－２蛋白在人胰腺痛组织和癌旁组织的表达差异，确定Ｔｒｏｐ－２与人胰腺癌临床病理特征的关系．本

研究采用组织芯片和免疫组化两种技术进行研究。万方数据