实验一 CTAB NaCl法细菌基因组DNA提取
实验一 大肠杆菌基因组提取
实验一大肠杆菌基因组提取简介大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的肠道菌，其基因组结构简单，可以用于实验室中的基因工程。
本实验将介绍如何从大肠杆菌中提取基因组DNA，并进行后续的测序和分析。
材料- 大肠杆菌菌株- SDS（1%）- NaCl(5M)- EDTA(0.5M)- 三氯乙酸(CTAB)细胞裂解缓冲液（含Tris-HCl,pH8.0、NaCl、CTAB和EDTA）- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液（pH8.0）- 75%酒精- 100%酒精步骤1. 建立大肠杆菌沙门氏菌联合培养通过将大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株联合培养，可以使大肠杆菌更具韧性，可以在更苛刻的条件下生存。
因此，在进行基因组提取前，可以将大肠杆菌与沙门氏菌一同培养。
具体步骤如下：1.1 从大肠杆菌与沙门氏菌培养基中选择处于对数生长期的菌株；1.2 筛选出同步菌种进行接吻结合；1.3 将大肠杆菌沙门氏菌接种于 LB 培养基中，进行生长，收集状态良好的菌落。
2. 细胞裂解收集培养的大肠菌细胞，经过洗涤后，加入细胞裂解缓冲液中。
在催化剂SDS的作用下，细胞质膜溶解，使DNA释放到缓冲液中。
2.1 用洗液洗细菌达到OD600为0.6时离心6000g， 10分钟；2.2 将上清液倒掉，沉淀用NaCl水洗涤后，离心6000g， 10分钟；2.3 将沉淀重悬于 Tris-HCl 缓冲液中，加入 SDS 、 NaCl和 EDTA，并在65℃下进行快速震荡混匀，直到完全均匀混合。
3. 蛋白酶和RNA酶的处理使用丙酮和氯仿的混合物沉淀DNA，过滤掉蛋白酶和RNA酶。
3.1 向上清液中加入等体积异丙醇，避免产生气泡，盖紧座析管盖，冰上静置10min 。
3.2 离心12000g 10min，弃取上清层。
将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，加入20ug/ml RNase 处理，65℃将体系涡旋5min；3.3 加入等体积氯仿，振荡10min，然后离心12000g 10min ，弃取上清液。
ctab法提取dna实验报告
ctab法提取dna实验报告CTAB 法提取 DNA 实验报告一、实验目的掌握 CTAB 法提取 DNA 的原理和操作方法，提取高质量的植物或微生物 DNA，为后续的分子生物学实验（如 PCR、基因测序等）提供纯净的 DNA 样本。
二、实验原理CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液中能与核酸形成复合物，并通过离心将其与蛋白质、多糖等杂质分离。
随后，用乙醇或异丙醇沉淀 DNA，使其从溶液中析出。
三、实验材料与试剂1、实验材料选取新鲜的植物叶片（或微生物培养物）。
2、实验试剂CTAB 提取缓冲液：2% CTAB，14 M NaCl，20 mM EDTA，100 mM TrisHCl（pH 80），02% β巯基乙醇（使用前加入）。
氯仿异戊醇（24 ： 1）异丙醇70% 乙醇TE 缓冲液（10 mM TrisHCl，1 mM EDTA，pH 80）四、实验仪器与设备1、高速冷冻离心机2、恒温水浴锅3、移液器4、涡旋振荡器5、微量紫外分光光度计五、实验步骤1、材料处理植物材料：取新鲜植物叶片约 2 g，用液氮速冻后研磨成粉末。
微生物材料：收集一定量的微生物培养物，离心收集菌体，用无菌水洗涤后重悬。
2、加入提取缓冲液将研磨好的植物粉末（或重悬的微生物）迅速转移至离心管中，加入预热至 65℃的 CTAB 提取缓冲液，充分混匀，65℃水浴保温 30 60 分钟，期间不时轻轻颠倒混匀。
3、抽提加入等体积的氯仿异戊醇（24 ： 1），涡旋振荡 10 15 分钟，使其充分混匀，然后 12000 rpm 离心 10 15 分钟。
4、转移上清用移液器小心吸取上清液至新的离心管中，避免吸取中间的蛋白质层。
5、 DNA 沉淀向上清液中加入 06 07 倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10 20 分钟，使 DNA 沉淀。
6、离心收集12000 rpm 离心 10 15 分钟，弃上清。
7、洗涤用 70% 乙醇洗涤沉淀 2 3 次，每次离心 5 10 分钟，弃上清。
细菌培养及菌体收集
基因工程实验流程参考图：细菌培养及菌体收集挑取单菌落于5 ml 2216E培养基中，8℃培养，100 rpm转速，振荡120 h后，12 000 rpm 离心15 min。
弃去上清液，加入10 ml TE洗涤离心后，用10 ml TE溶解菌体，混匀，–20℃保存备用。
实验一：菌株基因组DNA的提取（CTAB 方法）CTAB/NaCL溶液配制：CTAB/NaCL溶液(10% CTAB，0.7M NaCL 4.1gNaCL 溶于80ml 水中，缓慢加入10gCTAB，加热溶解)；原理：采用溶菌酶破碎细菌细胞壁，加入去污剂CTAB和EDTA消化细胞，可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
最后得到DNA。
操作流程：取3.5 ml菌悬液，加入184 μl 10% SDS，混匀，溶菌酶浓度为2mg/ml，37℃温育1 h。
加入740 μl 5 M NaCl，再加入512 μl CTAB/NaCl，混匀，65℃温育10 min。
加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10 000 rpm离心5 min，吸取上清液。
上清液中加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，10 000 rpm离心5 min，吸取上清液。
加入0.6倍异丙醇，混匀，10 000 rpm离心5 min，收集DNA沉淀，用70%乙醇洗涤DNA沉淀。
用1 ml TE溶解DNA，加入终浓度为20 μg/ml RNaseA，4℃溶解过夜，–20 ℃保存。
实验二：DNA电泳鉴定1．目的学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。
2．原理DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。
不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。
3．器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。
ctab法提取dna流程
CTAB法提取DNA流程引言DNA提取是分子生物学和遗传学研究中的基础实验之一，它可以用于从各种生物样品中纯化DNA，并用于进一步的分析和研究。
CTAB法是一种常用的DNA提取方法之一，其在提取DNA时使用了CTAB作为离子相互作用剂，能够有效地纯化DNA。
本文将详细介绍CTAB法提取DNA的流程。
实验材料与设备•样本：细菌、植物或动物组织样本•CTAB提取缓冲液：含有CTAB、EDTA和TRIS的缓冲液•醇类溶液：包括乙醇和异丙醇•氯仿•甲醇•高盐溶液：含有NaCl和CTAB的溶液•TE缓冲液：含有TRIS和EDTA的缓冲液•离心管•离心机•热平台实验步骤1. 样本处理1.将样本收集或制备成细胞输液。
2.使用离心机将细胞输液离心，分离得到细胞沉淀。
2. 细胞裂解1.向细胞沉淀中加入适量的CTAB提取缓冲液，并充分混匀。
2.放置于热平台上，在适当的温度下，通常为60°C-65°C，孵育一段时间，使细胞充分裂解。
3. 蛋白质沉淀1.将蛋白质沉淀剂（氯仿）加入到裂解液中，充分混匀。
2.离心管盖住盖子，以高转速离心，使裂解液分为上清液和沉淀两部分。
4. DNA沉淀1.将上清液转移到新的离心管中。
2.加入等体积的醇类溶液，充分混匀。
3.放置于冰箱中，使DNA在醇类溶液中沉淀。
5. DNA洗涤1.使用离心机将DNA沉淀离心，将上清液倒出，注意不要破坏DNA沉淀。
2.加入预冷的85%乙醇，使DNA沉淀溶解。
3.放置于冰箱中，使DNA在乙醇中沉淀。
4.重复以上步骤，直至DNA沉淀洗涤干净。
6. DNA溶解1.使用离心机将DNA沉淀离心，将上清液倒出。
2.加入适量的TE缓冲液，使DNA沉淀溶解。
结果与讨论通过CTAB法提取DNA的流程，我们可以成功地从细菌、植物或动物组织样本中获得高质量的DNA。
这种方法利用CTAB作为离子相互作用剂，能够有效地去除细胞的蛋白质和其他杂质，从而纯化DNA。
在DNA溶解的步骤中，使用TE缓冲液可以保护DNA的稳定性并提高其质量。
CTAB法提取DNA
试剂：1）2×CTAB提取液（PH8."0）：2%CTAB，1."4MNacl，0."02MEDTA，0."1MTris-cl，0."2%巯基乙醇。
即称取CTAB 2 g加蒸馏水40ml，加1M Tris-cl（PH8."0）10ml，0."5M EDTA（PH8."0）4ml和5M NaCl 28ml,待CTAB溶解后用蒸馏水定容到100ml（提取前加入2%的巯基乙醇，100ml加0."2ml巯基乙醇）2）1M Tris-cl（PH8."0）100 ml:12."11g Tris碱；ddH2O，80ml；HCl，4."9 ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8."0，定容至100ml3）0."5M EDTA（PH8."0）100ml：在80ml水中加入18."01g EDTANa2."2H2O搅拌溶解，用NaOH调PH至8."0（约2gNaOH颗粒），定容至100ml4）5M NaCl 100ml：称取29."22g NaCl，用ddH2O定容到100ml5）3M NaAc10ml：称取2."46g NaAc，用ddH2O定容到10ml操作步骤：1、称取1."0g幼嫩的叶片，在研钵中加入液氮预冷，将叶片放到液氮中研磨均匀，直至全部研磨至粉末，转入1."5ml离心管中，加入600 ul 65℃预热的CTAB溶液（用前加入2%的巯基乙醇）2、将装有CTAB和样品的EP管放入65℃水浴，约1h3、冷却后，加入600ul的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1=300:288:12)，混匀，12000rpm，离心15min4、吸上清，装入一新的EP管5、加入600ul氯仿：异戊醇（24:1=576:24），12000rpm。
CTAB法提取DNA步骤
CTAB法抽提DNA：所用药品:1.CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)2.EDTA (乙二胺四乙酸)3.Tris-base (三羟甲基氨基甲烷)Β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇操作步骤:注意: CTAB提取液加入0.2% beta-巯基乙醇预热10×TE溶液稀释为工作液.(1)CTAB提取液(2% w/v CTAB, 1.42 M NaCl, 20mM EDTA, 100mM Tris-Cl,0.2%beta-巯基乙醇) 在60°C预热；(2)研磨，并分装于700μL的抽提液；(3)65°C约30分钟，加入570μL 氯仿：异戊醇充分摇匀约15秒；(4)常温下13000rpm，离心10分钟，转移上清；(可重复步骤3一次)(5)加入0.7v/v的异丙醇，充分混匀，室温静置10-30分钟；(6)常温下13000rpm，离心10分钟，70%乙醇洗涤；(7) 去残液后空气干燥，15-20μLTE溶解，并电泳检测。
⑻用分光光度计进行DNA纯度检测(260nm, 280nm)(7)DNA浓度（1OD260nm≈50ug）淀粉酶活性实验(1)酶液制备：A: 称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加少量石英砂和2ml 蒸馏水，研磨成匀浆。
将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。
提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数min搅动1次，使其充分提取。
然后在3000rpm 下离心10min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。
吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。
B: 唾液淀粉酶液。
每组同学实验前自己制备，先用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，0.5 min后使其注入量筒并并稀释至200倍，混匀备用。
(2)1%淀粉溶液：将1g可溶性淀粉及0.3g 氯化钠混悬于5ml蒸馏水中，搅动后，缓慢倒入沸腾的60ml 蒸馏水中，搅动煮沸1min ，冷却至室温，加水至100ml, 置于冰箱中保存。
(一)细菌基因组DNA的提取
（一）细菌基因组DNA的提取1.试剂1）CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80mL H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100mL。
2）其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶K (20mg/mL或粉剂)，5mol/L NaCl。
2.操作步骤：1）100mL 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。
2）加9.5mL TE悬浮沉淀, 并加0.5 mL 10% SDS, 50 μL 20mg/mL(或1mg干粉)蛋白酶K, 混匀, 37℃保温1小时。
3）加1.5mL 5mol/L NaCl, 混匀。
4）加1.5mL CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。
5）用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。
6）用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。
7）加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。
8）用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1mL TE, -20℃保存。
如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。
（二）细胞基因组DNA的提取Each sample + TNES buffer 500 μL +proteinase K 25 μL → 55 °C, 750 rpm, 2hr →+150 μL 6M NaCl, vortex → spin 5 min, Max, romm temperature (RT) →isolate supernatant + 600 μL cold ethanol (95%), vortex → spin 5 min, Max, RT→ precipitation + 75% ethanol, RT, Vortex → spin 5 min, Max, RT →precipitation+50 μL TE buffer (10× stock solution), keep in 4 °C.（三）Chelex法抽提DNA1.用无菌棉签取双侧颊粘膜拭子，室温下自然干燥过夜，在无菌容器中保存。
CTAB法提取基因组DNA
CTAB法[30]提取玉米（或其余植物）基因组DNA1) 取 ~1 g 玉米叶片，加入液氮粉碎，加入2mL 2% 65℃保温的 2×CTAB抽提液，混匀， 65℃保温 30～60min。
2)加入等体积的氯仿 / 异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀， 10000r/min ，离心 5min。
3)取上清，加入 1/10 体积（约）的 65℃的 10× CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。
4)用等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24：1）抽提， 10000r/min ，离心 5min。
5)取上清，加入（正好）等体积的 CTAB积淀液，颠倒混匀，如积淀可见，持续做下步，否则， 65℃保温 30min。
6)4℃， 2700 r/min ，离心 5min。
7)去上清，用高盐的 TE buffer 重悬（～）。
（可 65℃保温 30min，至大多数溶解）。
8) 加入体积的异丙醇积淀核酸，充分混匀， 4℃， 10000 r/min ，离心 15min。
9) 去上清， 80%乙醇洗涤积淀，干燥，用尽可能少的 TE buffer 重悬。
高盐的 TE buffer终浓度配制 50ml10mM , (1M 母液 )0.1mM EDTA, (0.5M 母液 )1M NaCl 1.8g室温可保留几年CTAB提取液终浓度配制 200ml2%(W/V) CTAB 4g100mM , 20ml(1M 母液 )20mM EDTA, 8ml(0.5M 母液 )1.4M NaCl 10.22g室温可保留几年10×CTAB/NaCl溶液 (10%CTAB/0.7M NaCl)在 80ml H2O 中溶解 4.1g NaCl ，迟缓加入 10g CTAB，同时加热并搅拌。
如果需要，可加热至 65℃溶解。
定容至 100ml。
CTAB积淀液终浓度配制 100ml1%(W/V) CTAB 1g50mM , 5ml(1M 母液 )10mM EDTA, 2ml(0.5M 母液 )室温可保留几年CTAB法提取植物干品（或真菌）基因组DNA（自己改良版）10)取 0.2g 叶片，加入液氮粉碎，加入 800μL 2% 65℃保温的 2×CTAB抽提液，混匀， 65℃保温 30～60min。
SDS-CTAB改进方法提取细菌基因组DNA
改进SDS-CTAB方法提取细菌基因组具体步骤1.将待检测菌株接种于3 mL LB或BHI培养基中37℃培养过夜2.取1.5 mL上述菌液于2 mL离心管10,000~15,000 rpm，离心10~15 min，去上清，若所得菌体过少可重复此步骤一次3.加入564 μL TE缓冲液pH 8.0重悬菌体，此时不得涡旋，上下颠倒离心管几次使其混合均匀，然后37℃放置10~60 min。
4.加入30 μL 10%~20% SDS混合均匀、不得涡旋，置于37℃条件反应1~2h，使悬液相对清澈有粘性为止。
5.加入100μL 5M NaCl混合均匀、不得涡旋，65℃反应2 min。
然后加入80μL CTAB/NaCl，混合均匀、不得涡旋，65℃反应10 min。
（注：在加入CTAB/NaCl之前,必须用5M NaCl充分混匀裂解产物且CTAB/NaCl溶液加之前得先预热至65℃，并且吸取时移液器枪头应去除尖端）6.加入等体积约800 μL氯仿/异戊醇24:1充分混匀，10,000 rpm离心5 min。
离心后，转移含有核酸的上清液水相即上清液A，至新的2 mL 离心管中。
7.加入等体积约800 μL酚/氯仿/异戊醇25:24:于上清液A中充分混匀，15,000 rpm离心5 min。
离心后，转移含有核酸的上清液水相即上清液B，至新的2 mL离心管中。
8.加入等体积约800 μL氯仿/异戊醇24:1于上清液B中，充分混匀10,000 rpm离心5 min。
离心后，转移含有核酸的上清液水相即上清液C，至新的2 mL离心管中。
9.加入0.7倍体积约560 μL异丙醇至上清液C以沉淀DNA，上下轻柔颠倒离心管几次，可见白色、黏样沉淀即为DNA。
常温静置5~60 min后，12,000~15,000 rpm常温离心15~30 min。
可见DNA团集于离心管壁边上。
然后小心去除异丙醇，避免碰到DNA团。
10.加入500μL70%乙醇后上下颠倒离心管几次以洗涤DNA团，再常温12,000~15,000 rpm离心15~30 min。
CTAB法分离总基因组DNA
实验一CTAB法分离植物总基因组DNA 本方法适用于从一系列的单子叶和双子叶植物中提取总DNA，产率一般为100－200μg/g鲜重组织。
药品试剂――液氮――2×CTAB缓冲液：100mmol/L Tris-HCL pH8.0,1.4mol/L NaCl,20mmol/L EDTA pH8.0, 2%CTAB, 0.7%(v/v) β－巯基乙醇（用前加入）――氯仿／异戊醇（24：1）――RNaseA：取100mg RNase溶于10ml含有10mmol/L Tris(pH7.5),15mmol/L NaCl的溶液中，配成10mg/ml的浓度，100℃热处理15min除去残留的DNase 活性，分装成小份-20℃保存。
――异丙醇Ac――76％乙醇＋10mMNH4――70％乙醇――TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA pH8.0仪器设备――天平――研钵和杵子――离心管――37℃、65℃、水浴――液氮――离心机（转速至少可达5000r）操作程序1、向装有700－800mg磨碎的干燥植物组织（最好是经去淀粉处理）的50ml聚丙烯离心管中加入20ml 65℃预热的1×CTAB提取缓冲液。
轻轻转动离心管使植物组织在提取缓冲液中均匀分散，65℃温育90min，并不时轻轻转动离心管。
或者，将10g经去淀粉处理的新鲜植物材料用液氮速冻，在研钵中将其磨碎，在化冻之前将粉末转移至一50ml聚丙烯离心管中，然后加入20－40ml预热至90℃的2×CTAB提取缓冲液。
轻轻转动离心管，混匀，然后置于65℃水浴放置60－90min。
2、混合物冷至室温后加入等体积的氯仿／异戊醇。
温和摇动15－40min使之充分混合。
室温下5000g离心10－15min分相。
3、将上清（水相）转移至一干净离心管中，加入1／100体积RNase贮液，颠倒混匀，37℃保温30min。
细菌基因组的提取--CTAB
细菌基因组的提取——CTAB法准备试剂：TE缓冲液10% 的SDS20 mg/ml 蛋白酶K（分装好后保存于-20度）5 M NaClCTAB/ NaCl 溶液24:1 氯仿：异戊醇25:24:1 酚：氯仿：异戊醇异丙醇70%乙醇3M 乙酸钠（pH5.2）50ml 的离心瓶实验流程：1、将过夜培养的阴沟肠杆菌（Amp抗性）种子菌按1%的接种量转接于一瓶100mL 液体LB培养基中，37度，200rpm 培养月2h ,使其进入对数期（OD600为0.6）。
2、离心收集菌体（4000×g,10min 例如在JA-20转子的离心机上是6000rpm），倒掉上清。
3、收集好的菌体用9.5 mL TE缓冲液重悬（重悬的时候要轻柔），并加入0.5 mL10%SDS和50 μL 20mg/mL 的蛋白酶K，轻轻的颠倒试管是溶液混合充分，于37度水浴1h。
（处理完后的溶液应该很粘稠，不需要用溶菌酶预先处理）4、向上步的处理液中加入1.8 mL 5 M NaCl，充分混匀。
（这一步至关重要，因为在室温若是盐离子浓度下降至0.5M时，就会形成CTAB-核酸沉淀，CTAB 能与细胞壁碎片、变性的蛋白质及多糖形成复合体，而核酸仍然存在于溶液中）5、向上步溶液中加入1.5mL CTAB/ NaCl 溶液，充分混匀后于65度水浴10min。
6、用等体积的氯仿：异戊醇抽提，混合充分后，室温6000×g离心10min（JA-20转子的离心机上是7000rpm）7、将上层水相用大口径的移液枪将其转移到另一干净管中。
（若是基因组含量很高的话上层水相将会非常粘稠，可以另外再用氯仿：异戊醇或是酚：氯仿：异戊醇进行抽提）8、用0.6倍体积的异戊醇沉淀收集的上清（加入异丙醇后混合充分静置约10min），这时会出现白色絮状沉淀，将白色絮状沉淀转移另一干净的EP管中，用1 mL 70%乙醇清洗。
9、10,000×g（JA-20转子的离心机上是9900rpm）离心5min,去掉上清，沉淀用真空冷冻机抽干，溶于4 mL TE缓冲液（这一过程可能要很长一段时间—几个小时甚至是过夜，也可以吧它放于60度以加快DNA的溶解）小提：1、生长到对数期离心收集菌体2、收集好的菌体用567μL TE缓冲液重悬（重悬的时候要轻柔），并加入3μL 10%SDS和3μL 20mg/mL 的蛋白酶K，轻轻的颠倒试管是溶液混合充分，于37度水浴1h。
实验一--CTAB法提取植物基因组
实验一--C T A B法提取植物基因组D N A(总3页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--实验一 CTAB法提取植物基因组DNA实验目的：学习从植物组织中（幼叶）提取基因组DNA的基本原理和方法。
实验原理：采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类），其对DNA的抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐的溶液中（>L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。
CTAB溶液在低于15度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中之前必须预热（65度），且离心温度不要低于15度。
实验步骤：1、取幼嫩的植物叶片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入离心管内。
加入等体积的65℃预热的DNA提取缓冲液置于65℃的恒温水浴摇床上1-2h。
2、加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，之后于12000rpm离心10分钟。
3、吸取上层水相，重复步骤2一次。
4、吸取上层水相，加入预冷2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20℃冰箱内10min，待DNA沉淀后于12000rpm离心收集，收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。
将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。
5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA（10mg/ml），37℃保温1h以除去DNA中的RNA。
6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：异戊醇（24：1）轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。
(完整版)实验一CTABNaCl法细菌基因组DNA提取
实验一CTAB/NaCl 法细菌基因组DNA提取一、培养基A. LB培养基（1L）胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g pH调至7.0二、菌种大肠杆菌野生型三、缓冲液A. 1M Tris-HCl ( pH 8.0, 1L)1.称量121.1 g Tris置于l L烧杯中，加入约800 ml的ddH2O，充分搅拌溶解，加浓HCl约42ml，将溶液定容至1 L。
C. TE缓冲液（pH 8.0）10 mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)D. 10% SDS溶液10 gSDS，定容至100mlE. CTAB/NaCl缓冲液CTAB 4gNaCl 16.364 g1M Tris-HCl 20ml ( PH8.0)0.5M EDTA 8ml先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌，冷却后0.2-1% β-巯基乙醇（400ul）。
F. 5mol/L NaCl溶液292.5 gNaCl了，定容至1LG. 氯仿：异戊醇（24：1）480ml氯仿+20ml异戊醇，混匀存放至棕色瓶备用。
H. 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）250mlTris饱和酚+240ml氯仿+10ml异戊醇，混匀存放至棕色瓶备用。
I. 上样缓冲液（6×）0.25%溴酚蓝，20%蔗糖J. 电泳缓冲液（1×, 1L）Tris碱10.8g，硼酸5. 5g，0.5mol/L EDTA （pH8.0）4ml, 用ddH2O定容至1L。
K. 0.7%琼脂糖凝胶（100 ml）0.7 g琼脂糖凝胶, 加入1×电泳缓冲液，微波炉加热至凝胶完全融化即可三、实验具体步骤1、接种一单菌落于5mlLB中, 30℃培养过夜,2、取1ml种子培养液接入100ml LB中, 37℃、220r/min培养16小时;3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。
4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀。
细菌dna的提取方法
细菌dna的提取方法
一、水煮模板法——主要用于PCR反应
操作Z简便，对试剂条件要求低。
缺点是纯度不够高，可能会含有RNA、蛋白等杂质。
但是作为一般检测目的的PCR反应模板已经足够了。
二、CTAB/NaCl 法
CTAB/NaCl法提取的DNA纯度较高，蛋白杂质较少，保存时间长，编者更喜欢把终浓度为20μg/ml RnaseA加在第5步温育的时候，这样Z后没有RnaseA污染。
每一步操作细致一些，得到的DNA 可用于Southern blot。
注意：长时间保存DNA可放于-20℃，但要尽量减少反复冻融，否则影响DNA质量。
三、盐析法
介于方法一和方法二之间，CTAB虽然取出糖分效果较好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放弃了CTAB。
实验注意：提基因组Z好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆滑）。
以免枪头损伤基因组，抽干时Z 好是风干。
实验一--CTAB法提取植物基因组DNA.doc
实验一--CTAB法提取植物基因组DNA.doc
CTAB法是一种提取植物基因组DNA的标准技术，它是将植物组织或细胞固定剂与有机溶剂混合溶解后，利用高通量PCR技术显微镜适用的植物DNA提取方法，将病毒与细菌遗
传学上的DNA提取技术应用到植物DNA提取上来。
CTAB法的提取策略主要是先收缩细胞壁，然后分解细胞质，使DNA与蛋白质、核酸等其他物质分离。
有两种方法可以用于收缩细胞壁，一种是使用脱水剂，另一种是使用温和
的柱状体破碎物质，这两种方法可以使细胞壁被开裂。
随后，有机溶剂被用来分离DNA，
有机溶剂会与蛋白质和核酸结合，然后消除组织成份，使DNA易于收集。
在有机溶剂洗涤后，用CTAB溶液在冰上半小时沉淀DNA，紧接着用脱盐水冲洗，最后用70%的乙醇对DNA
进行沉淀。
最后，DNA可以被收集，净化，脱水或冻存，随时可用。
此外，为了获得精确的结果，在使用CTAB法提取植物基因组DNA时也有一些需要考
虑的因素，其中包括样本所处的第一步，样品消毒，采取合适的收缩细胞壁和有机溶剂剂量，CTAB溶液沉淀时间，脱盐水洗涤次数，乙醇沉淀次数，DNA注射缓冲液等，如果这些
步骤都能得到恰当的处理，则可以保证获得的 DNA 极为纯净。
为了提高植物DNA提取效率，CTAB法在提取植物基因组DNA时也可以使用DNA限制酶，例如酸性磷酸酶和热胡萝卜素变性酶之类的酶，这种方法可以使细胞壁更易被分解，从而
使DNA更容易被收集。
总而言之，CTAB法提取植物基因组DNA是一种比较有效的方法，能够获得更高质量的DNA，但是在使用这种技术提取植物DNA时，需要注意一些关键的步骤及酶的使用，以确
保获得的DNA有较高的纯度。
CTAB法提取基因组DNA
CTAB法[30]提取玉米（或其它植物）基因组DNA1)取~1 g玉米叶片，加入液氮粉碎，加入2mL 2% 65℃保温的2×CTAB抽提液，混匀，65℃保温30～60min。
2)加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，10000r/min，离心5min。
3)取上清，加入1/10体积（约）的65℃的10×CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。
4)用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，10000r/min，离心5min。
5)取上清，加入（正好）等体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，如沉淀可见，继续做下步，否则，65℃保温30min。
6)4℃，2700 r/min，离心5min。
7)去上清，用高盐的TE buffer重悬（～）。
（可65℃保温30min，至大部分溶解）。
8)加入体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀，4℃，10000 r/min，离心15min。
9)去上清，80%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TE buffer重悬。
高盐的TE buffer终浓度配制50ml10mM , (1M 母液)0.1mM EDTA, (0.5M 母液)1M NaCl 1.8g室温可保存几年CTAB提取液终浓度配制200ml2%(W/V) CTAB 4g100mM , 20ml(1M 母液)20mM EDTA, 8ml(0.5M 母液)1.4M NaCl 10.22g室温可保存几年10×CTAB/NaCl溶液(10%CTAB/0.7M NaCl)O中溶解4.1g NaCl，缓慢加入10g CTAB，同时加热并搅拌。
如果需在80ml H2要，可加热至65℃溶解。
定容至100ml。
CTAB沉淀液终浓度配制100ml1%(W/V) CTAB 1g50mM , 5ml(1M 母液)10mM EDTA, 2ml(0.5M 母液)室温可保存几年CTAB法提取植物干品（或真菌）基因组DNA（自己改进版）10)取0.2g叶片，加入液氮粉碎，加入800μL 2% 65℃保温的2×CTAB抽提液，混匀，65℃保温30～60min。
CTAB法提取微生物DNA
CTAB法提取微生物DNACTAB法提取细菌DNA一.细菌总DNA提取1.将菌株接种于液体LB培养基中，37℃震荡培养过夜。
2.取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3.沉淀物加入567μl的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30μl 10%SDS和15μl的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。
4.加入100μl 5mol/L NaCl，加入80μl CTAB/ NaCl溶液，混匀后65℃温育10min。
5.加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min，将上清转入另一只离心管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，沉淀可稍微离心。
6.沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇，在洁净工作台稍加干燥，重溶于20μl TE缓冲液（含RNaseA＜25ng/ml）中，准备电泳检测。
二．琼脂糖凝胶电泳。
1. 制胶：称取琼脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE缓冲液配成0.8%的浓度，加热脂使琼脂糖全部融化于缓冲液中，待溶液温度降至65℃时，立即倒入制胶槽中，插入样品梳。
在室温放置0.5-1h，待凝胶全部凝结后，轻轻拔出样品梳。
然后在电泳槽中加入电泳缓冲液直到没过凝胶为止。
2.加样：取0.5-1 ug 左右的样品，体积为10-20ul，加入1/4体积的溴酚兰-甘油指示剂，混匀后小心地加到样品槽中。
同时另取一个已知分子量的标准DNA 水解液，在同一凝胶板上进行电泳。
3. 电泳：维持恒压100V，电泳0.5-1h，直到溴酚兰指示剂移动到凝胶底部，停止电泳。
4. 染色：将凝胶取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1h。
染液可反复多次使用。
5. 观察：将凝胶板置于254nm波长紫外灯下进行观察。
DNA存在的位置呈现橙黄色荧光。
CTAB法提取真菌DNA1. 真菌培养菌丝，真空抽滤后，无菌水洗涤3次，再用80％乙醇洗1次。
2. 取50mg左右吸干的新鲜菌丝，加入600ul2×CTAB 提取缓冲液(含0.7mol/L NaC1，100mmol/L Tris-HC1 pH8.0，20 mmol/L EDTA ，10 g/L PVP-360，20g/LCTAB ,0.1％13-巯基乙醇) ，少许灭菌石英砂，在研钵中将菌丝充分研磨。
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实验一CTAB/NaCl 法细菌基因组DNA提取
一、培养基
A. LB培养基（1L）
胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g pH调至7.0
二、菌种
大肠杆菌野生型
三、缓冲液
A. 1M Tris-HCl ( pH 8.0, 1L)
1.称量121.1 g Tris置于l L烧杯中，加入约800 ml的ddH2O，充分搅拌溶解，加浓HCl约42ml，将溶液定容至1 L。
C. TE缓冲液（pH 8.0）
10 mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)
D. 10% SDS溶液
10 gSDS，定容至100ml
E. CTAB/NaCl缓冲液
CTAB 4g
NaCl 16.364 g
1M Tris-HCl 20ml ( PH8.0)
0.5M EDTA 8ml
先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌，冷却后0.2-1% β-巯基乙醇（400ul）。
F. 5mol/L NaCl溶液
292.5 gNaCl了，定容至1L
G. 氯仿：异戊醇（24：1）
480ml氯仿+20ml异戊醇，混匀存放至棕色瓶备用。
H. 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
250mlTris饱和酚+240ml氯仿+10ml异戊醇，混匀存放至棕色瓶备用。
I. 上样缓冲液（6×）
0.25%溴酚蓝，20%蔗糖
J. 电泳缓冲液（1×, 1L）
Tris碱10.8g，硼酸5. 5g，0.5mol/L EDTA （pH8.0）4ml, 用ddH2O定容至1L。
K. 0.7%琼脂糖凝胶（100 ml）
0.7 g琼脂糖凝胶, 加入1×电泳缓冲液，微波炉加热至凝胶完全融化即可
三、实验具体步骤
1、接种一单菌落于5mlLB中, 30℃培养过夜,
2、取1ml种子培养液接入100ml LB中, 37℃、220r/min培养16小时;
3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。
4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀。
5、取1.4ml菌悬液,加入73.6μl10%SDS,混匀,加入14.8μl10mg/ml蛋白酶K, 混匀, 37℃温育1小时
6、加入296μl 5mol/LNaCl, 再加入204.8μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。
（注：总体积约2ml）
7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。
8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。
9、加入0.6倍体积的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA
沉淀,10000r/min离心5分钟，弃上清液，沉淀即总DNA。
10、用1mlTE溶解DNA,取5μl在琼脂糖电泳中上样检测。