实验一 CTAB NaCl法细菌基因组DNA提取

实验一CTAB/NaCl 法细菌基因组DNA提取

一、培养基

A. LB培养基（1L）

胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g pH调至7.0

二、菌种

大肠杆菌野生型

三、缓冲液

A. 1M Tris-HCl ( pH 8.0, 1L)

1.称量121.1 g Tris置于l L烧杯中，加入约800 ml的ddH2O，充分搅拌溶解，加浓HCl约42ml，将溶液定容至1 L。

C. TE缓冲液（pH 8.0）

10 mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)

D. 10% SDS溶液

10 gSDS，定容至100ml

E. CTAB/NaCl缓冲液

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml ( PH8.0)

0.5M EDTA 8ml

先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌，冷却后0.2-1% β-巯基乙醇（400ul）。

F. 5mol/L NaCl溶液

292.5 gNaCl了，定容至1L

G. 氯仿：异戊醇（24：1）

480ml氯仿+20ml异戊醇，混匀存放至棕色瓶备用。

H. 酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）

250mlTris饱和酚+240ml氯仿+10ml异戊醇，混匀存放至棕色瓶备用。

I. 上样缓冲液（6×）

0.25%溴酚蓝，20%蔗糖

J. 电泳缓冲液（1×, 1L）

Tris碱10.8g，硼酸5. 5g，0.5mol/L EDTA （pH8.0）4ml, 用ddH2O定容至1L。

K. 0.7%琼脂糖凝胶（100 ml）

0.7 g琼脂糖凝胶, 加入1×电泳缓冲液，微波炉加热至凝胶完全融化即可

三、实验具体步骤

1、接种一单菌落于5mlLB中, 30℃培养过夜,

2、取1ml种子培养液接入100ml LB中, 37℃、220r/min培养16小时;

3、5000r/min离心10分钟,弃去上清。

4、加入10mlTE离心洗涤后,用10mlTE溶解菌体,混匀。

5、取1.4ml菌悬液,加入73.6μl10%SDS,混匀,加入14.8μl10mg/ml蛋白酶K, 混匀, 37℃温育1小时

6、加入296μl 5mol/LNaCl, 再加入204.8μlCTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。（注：总体积约2ml）

7、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。

8、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。

9、加入0.6倍体积的异丙醇,混匀,10000r/min离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA

沉淀,10000r/min离心5分钟，弃上清液，沉淀即总DNA。

10、用1mlTE溶解DNA,取5μl在琼脂糖电泳中上样检测。