血液蛋白质组学的研究技术及进展
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生
物
技
术
通
讯源自文库
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文章编号： !""#$"""%&%""’(")$"’’*$")
综
述
血液蛋白质组学的研究技术及进展
巩燕， 李晓海， 应万涛， 蔡耘， 钱小红
军事医学科学院 放射医学研究所， 北京 !""+*" ；北京蛋白质组研究中心， 北京 !"%%"’ ［ 摘要］ 人血液含有来源于几乎所有细胞、 组织、 器官的蛋白质， 可以直接反映病理、 生理状态， 是各种疾病诊断、 生物标志 列为首 物发现的最有价值的标本。因此， 长期以来， 血浆蛋白质组一直是人们研究的热点， 并被人类蛋白质组组织（ ,-./ ） 批启动的重大国际合作研究项目。 血浆蛋白质含量动态范围非常广、 成分极其复杂， 血浆蛋白质组的研究极富挑战性。 近年 质谱鉴定、 数据处理等多种相关技术都取得了很大的进展。本文简要综述了 来， 血浆高丰度蛋白质去除、 蛋白质 0 肽段分离、 上述技术领域的研究和应用进展。 ［ 关键词］ 血浆； 蛋白质组； 样品处理 ［ 中图分类号］ 12+# ［ 文献标识码］ 3
N
基于不同样品预处理方法的血浆 蛋 白 质 多 维 色 谱
%EJJI/ R&U"L28 免疫亲和色谱柱，前者已在 +VVV 项目中得到
广泛应用。 %EJJI/ R&U"L28OQP可以一次性去除 28 种高丰度蛋白， 去除效率达 WQXYWW1QX。+6HF; 等 O:P对免疫亲和去高丰度蛋白的 方法进行了改进， 在血清样品中加入 QX 的乙腈来破坏 蛋 白 间 的 相互作用， 从而在去除高丰度蛋白的同时 ， 避免了因非特异性吸 变性 条 件 下 去 除 附造成的低丰度蛋白的损失。 8AL" 结果表明， 高丰度蛋白质能得到更多的蛋白质点， 尤其是低分子量蛋白质。 目前很多实验室对以上多种方 法 的 有 效 性 、 特 异 性 等 进 行 了评价比较。 $HDG?I/ 等 O3P对 8 种商业化的试剂盒 +%>ABEJ0E?C/F （ 和 +%> Z &;,AIED/[H0 （ RC00CJ/IE 公 司 ） >DEIGKHD (C/G=CEF=EG 公 司） 进行了评价， 前者基于亲和染料， 后者基于免疫亲和。他们用 技术结合液 \]"%# （ \6HF?C^C=H?C/F ]GCF; "FKHF=EB %C;FH0 #H;G） 相色谱 （ !* ） A 傅立叶变换离子回旋共振质谱 （ </6ICEI ?IHFG^/ID 定量方法 <#&*$ R% ） C/F =T=0/?I/F IEG/FHF=E DHGG GJE=?I/DE?IT， 结果表明， 基于免疫亲和的试 来比较去除前后 +%> 和 &;, 的量， 剂 盒 的 去 除 效 果 更 好 。 *KI/DT 等 O_P 用 二 维 差 异 凝 胶 电 泳 （ ?@/A
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分离! 质谱鉴定策略
基于多维色谱的规模化蛋白质组研究技术具有重现性好、 分离效果好、 检测动态范围宽、 易于实现高通 量 、 自动化等优势， 已显示出明显的优势和潜力，在血浆 蛋 白 质 组 研 究 中 发 挥 了 重 要 作 用 。 %KEF 等
O29P
用高效纳升级反相色谱 （ IE[EIGEBAJKHGE
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给各个实验室分发 .E>6C> .F;7:;C: .F;I:A7， ,...( 的 初 级 阶 段 ， 同样的样品， 以评价不同技术路线得到的蛋白质鉴定情况。
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血浆高丰度蛋白质去除技术
血浆高丰度蛋白的去除至关 重 要 ， 可 明 显 提 高 低 丰 度 蛋 白
［ 9": ;+,5)］ OE>6C>K OF;7:;C:K 6>COE: 7F:>7C:57 血浆蛋白质组具有下列显著特点 ： ! 血 浆 蛋 白 质 组 是 最 复 杂的蛋白质组学研究对象， 它含有至少 ! 万种蛋白质。这是因为 血浆蛋白质来源广泛， 几乎包括所有细胞、 组织、 器官的蛋白。另 外， 还存在大量的蛋白质剪切体、 翻译后修饰（ 特别是糖基化） 、 降解片段， 其中仅免疫球蛋白就有上百万种蛋白形式。" 血浆蛋 白质丰度差异巨大， 远远超过目前分离鉴定 所 达 到 的 动 态 范 围 。 在血浆 0 血清中的含 人血清白蛋白（ L9C>5 6:F9C >EN9C85 ， ,G3 ） 量最高，约占所有蛋白质总量的 *"X； 如 %% 种最高丰度的蛋白， 所鉴定的蛋白质也不同，因而人们 发 展 了 各 种 各 样 的 技 术 以 互 补， 以尽可能多地鉴定蛋白质。人类蛋白质组组织（ ,9C>5 .F;V
［ 收稿日期］ %""’$"!$!" ［ 基金项目］国家自然科学基金项目（ %")"*"!2 ， ^"^%!""^ ） ［ 作者简介］巩燕（ ， 女， 博士研究生 !#22$ ） ［ 通讯作者］钱小红， （ _$C>8E ） ‘8>5UL!aD>L;;PA;CPA5
:::
去血清中的脂类及不溶成分， 后 用 细 菌 蛋 白 , 除 去 &;, （ 蛋白 , 可以特异地 与 &;, 的 <= 区 结 合 ） ，最后用氯化钠和乙醇来沉淀 银染的二维凝胶电泳（ +%>， ?@/ABCDEFGC/FH0 ;E0 E0E=?I/JK/IEGCG， 表明该法重复性好， 可 比 较 有 效 地 去 除 +%> 和 &;, ； 与高 8AL" ） 丰度蛋白去除前相比， 可以多显现 499 多个蛋白质点。 基 于 染 料 亲 和 的 方 法 也 可 去 除 高 丰 度 蛋 白 质 。 用 *CMIH=/F 但 (06E <N,A> 去除血浆中的 +%>，简单且一次处理样品 量 大 ， 特异性和有效性较差。 血浆中的胆红素及脂肪酸会与 +%> 结合， 使 +%> 很难再与该染料结合。 (H6GGHF? 等 O4P发展了一种基于肽的 对 +%> 特异性去除 +%> 的方法。蛋白 , 对 &;, 有特异的结 合 ， 有非特异的结合， 他们对与 +%> 有结合作用的 4Q 个氨基酸进行 蛋白质工程方面的改造， 使蛋白 , 对 +%> 的结合力更强。 除了以上较简单的去除高丰度 蛋 白 的 方 法 ， 人 们 还 探 索 用 免疫亲和来去除多种高丰度蛋白。免 疫 亲 和 方 法 的 引 进 使 高 丰 度蛋白质的去除在特异性、 有效性、 重复 性 方 面 得 到 了 极 大 的 提 高， 目前已开发出可以同时去除 : 种 或 28 种 血 浆 高 丰 度 蛋 白 质 的免疫亲和色谱柱，如 >;C0EF? 公司的 R>$% 和 ,EFSHT 公司的
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,G3、 4JY、运铁蛋白、 #%$ 巨球蛋白、 #!$ 抗胰蛋白酶等占 血 浆 总
蛋白质含量的 ##X 以上， 而其余不足 !X 的由上万种低丰度蛋白 构成。高、 低丰度蛋白的浓度可差 !"!% 数 量 级 ， 是目前血浆蛋白 质组发展的瓶颈所在。鉴于血浆包含血清的所有成分， 且两者成 分差异较少， 为叙述方便， 在无文献特殊指定的情况下， 仅以血 浆为代表进行综述。 早于人们对基因的认识， 大 血 浆 蛋 白 质 的 研 究 历 史 悠 久 Z![， 体经历了以下几个时期： ! 早期的探索 研 究 及 利 用 化 学 方 法 进 行分级研究时期； " 利用生化方法进行酶活 性 研 究 时 期 ； $抗 体 及单克隆抗体研究时期； 鉴定技术的蛋 % 主要依赖于样品 分 离 、 白质组及基因组学研究时期。近 2" 年来 ， 被分离鉴定的蛋白质 种类随蛋白质组学技术的发展几乎呈指数递增。技术路线不同，
质的上样量、 色谱分离的峰容量和质谱检测的动态范围。根据蛋 白质的理化性质， 如等电点、 相对分子质量、 疏水性、 表面电荷、 三维结构等， 可以去除血浆中的高丰度蛋白质。基于相对分子质 量和等电点的不同， \>685J:F 等
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用 YF>?8<E;TW@ 技 术 去 除 了
从而降低其对其他蛋白质的干扰， 同时也降低样品的复杂 ,G3， 性， 但这种方法的特异性很差。有机溶剂沉淀法也用于高丰度蛋 白的去除， 特别是高分子量蛋白质的去除。 ]9 等 Z^[用离心法先除
FHF/=HJC00HIT 0C‘6CB =KI/DH?/;IHJKT ， FHF/$V!* ） 分 离 血 浆 肽 段 ，
峰 容 量 达 2 999 ， 再 加 上 离 线 强 阳 离 子 交 换 （ G?I/F; =H?C/FAEab 分离， 使经过二维色谱分 %*U!* ） =KHF;E 0C‘6CB =KI/DH?/;IHJKT ， 比常规的 8LA!* 峰容 量 高 一 个 离的肽段的峰容量达到 29 999 ， 数量级， 最 终 用 N:Q !; 血 浆 鉴 定 出 了 2 :_8 种 蛋 白 ， 所鉴定的 用更小内径（ 的反相色谱柱 蛋白浓度相差达 _ 个数量级； 2Q !D） 进行分离， 发现灵敏度更高， 样品需求量 更 少 。 该 研 究 显 示 了 超 高分离性能的毛细管色谱与高灵敏度 的 纳 喷 电 喷 雾 质 谱 仪 联 用 在血浆蛋白质分离鉴定中诱人的应用 前 景 。 这 是 迄 今 鉴 定 蛋 白 数目最多的一种研究策略。 对 5CF 等 O22P用 在 线 %*U!* 和 $V!* 对 血 浆 蛋 白 进 行 预 分 离 ， 得到的 N9 个组分进行酶切和反相分离 A线性离子阱（ 8AL &#R% ） 鉴定， 得到 2 8W8 种蛋白质， 表明在蛋 白 水 平 上 进 行 充 分 分 离 有 利于更深入地研究蛋白质组。 %KEF; 等 O28P优化了血清蛋白质 V<8L 二维整体蛋白质分离技术， 并鉴 定 了 血 清 蛋 白 质 。 V<8L 第 一 维 为色谱聚焦， 第二维为反相色谱。第一维分离加入 89X 异丙醇改 善了分离效果， 除 &;, 和 +%> 外， 2QN 种蛋白 得 以 鉴 定 （ 8 个或 8 个以上肽段） 。作者认为在蛋白水平上进行预分离可以提高肽段 覆盖率， 从而更可能得到蛋白的翻译后修饰信息， 如可变体等。 临床蛋白质组研究需采用高通 量 、 稳 定 的 系 统 来 处 理 大 量 用相当于 914 的样品。 <6cCC 等 O2NP在去除血清中的 +%> 和 &;, 后，
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!"##"$% &’ (&)#"*+’)!),差异蛋白质组方面的研究。
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基于不同样品预处理方法的血浆蛋白质电泳分离 !
质谱鉴定策略
由于血浆蛋白浓度动态范围非常广， 而 %L%AV>," 和 8AL" 存在动态范围窄及其他方面的缺陷， 使 其 在 血 浆 蛋 白 质 组 研 究 中的应用较少。 5CF 等 OWP用 R>$% 亲 和 柱 去 除 : 种 血 清 高 丰 度 蛋 后 用 二 维 液 相 色 谱A离 子 白后， 用 %L%AV>," 对 蛋 白 进 行 分 离 ， 阱串联质谱（ 对酶解后的肽段进行分离鉴 8AL !* Z "%&AR% Z R% ） 定， 共得到 4W4 种蛋白。除了用 +VVV 推荐的质谱数据过滤参数 外，还用从 %L%AV>," 所得到的蛋白质相对分子质量信息与鉴 定结果比较（ 同时考虑蛋白质翻译后修饰和降解） ， 经过严格过 滤后共鉴定了 8W8 种蛋白。
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血液蛋白质组学的研究技术及进展
巩燕， 李晓海， 应万涛， 蔡耘， 钱小红
军事医学科学院 放射医学研究所， 北京 !""+*" ；北京蛋白质组研究中心， 北京 !"%%"’ ［ 摘要］ 人血液含有来源于几乎所有细胞、 组织、 器官的蛋白质， 可以直接反映病理、 生理状态， 是各种疾病诊断、 生物标志 列为首 物发现的最有价值的标本。因此， 长期以来， 血浆蛋白质组一直是人们研究的热点， 并被人类蛋白质组组织（ ,-./ ） 批启动的重大国际合作研究项目。 血浆蛋白质含量动态范围非常广、 成分极其复杂， 血浆蛋白质组的研究极富挑战性。 近年 质谱鉴定、 数据处理等多种相关技术都取得了很大的进展。本文简要综述了 来， 血浆高丰度蛋白质去除、 蛋白质 0 肽段分离、 上述技术领域的研究和应用进展。 ［ 关键词］ 血浆； 蛋白质组； 样品处理 ［ 中图分类号］ 12+# ［ 文献标识码］ 3
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基于不同样品预处理方法的血浆 蛋 白 质 多 维 色 谱
%EJJI/ R&U"L28 免疫亲和色谱柱，前者已在 +VVV 项目中得到
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基于多维色谱的规模化蛋白质组研究技术具有重现性好、 分离效果好、 检测动态范围宽、 易于实现高通 量 、 自动化等优势， 已显示出明显的优势和潜力，在血浆 蛋 白 质 组 研 究 中 发 挥 了 重 要 作 用 。 %KEF 等
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血浆高丰度蛋白质去除技术
血浆高丰度蛋白的去除至关 重 要 ， 可 明 显 提 高 低 丰 度 蛋 白
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基于不同样品预处理方法的血浆蛋白质电泳分离 !
质谱鉴定策略
由于血浆蛋白浓度动态范围非常广， 而 %L%AV>," 和 8AL" 存在动态范围窄及其他方面的缺陷， 使 其 在 血 浆 蛋 白 质 组 研 究 中的应用较少。 5CF 等 OWP用 R>$% 亲 和 柱 去 除 : 种 血 清 高 丰 度 蛋 后 用 二 维 液 相 色 谱A离 子 白后， 用 %L%AV>," 对 蛋 白 进 行 分 离 ， 阱串联质谱（ 对酶解后的肽段进行分离鉴 8AL !* Z "%&AR% Z R% ） 定， 共得到 4W4 种蛋白。除了用 +VVV 推荐的质谱数据过滤参数 外，还用从 %L%AV>," 所得到的蛋白质相对分子质量信息与鉴 定结果比较（ 同时考虑蛋白质翻译后修饰和降解） ， 经过严格过 滤后共鉴定了 8W8 种蛋白。