第九章吸光光度法分析
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绿 蓝绿 绿蓝 蓝
23:26:59
单色光 复合光 光的互补
黄绿 黄 橙 红
紫 紫红
光谱示意
复合光
表观现象示意
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
23:26:59
光吸收原理
物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了 物质对光的选择吸收基础。分子的紫外-可见吸收光谱是由电子 跃迁引起的，故又称电子光谱.
在实际工作中，入射光通常具有一定的带通。为了避免非单色 光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。 选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。 23:27:00
吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离
质点间的静电作用
质点间的缔合作用
质点间的化学反应
23:27:00
9-2 光度计及其基本部件
0.575
光源 参比 I0
23:27:00
棱镜—根据光的折射现象进行分光
棱镜对不同波长的光具有不同的折射率，波长长的光， 折射率小；波长短的光，折射率大。
平行光经过棱镜后按波长顺序排列成为单色光；经聚焦
后在焦面上的不同位置上成像，获得按波长展开的光谱；
棱镜的光学特性可用色散率和分辨率来表征；
23:27:00
光栅
通过在平板玻璃或金属板上刻划出一道道等宽、等间 距的刻痕制成。常用的光栅刻痕密度每毫米为1200条、 1800条或2400条； 根据工作方式不同分为：
取值与浓度的单位相关 c：mol / L
K （或k）
摩尔吸光系数， L ·mol –1 ·cm -1
A cb
吸光系数， L ·g –1 ·cm -1
c： g / L
K a
A acb
比吸光系数 100mL ·g –1 ·cm -1
c：g / 100 mL K E1% 1cm
（2）溶液的酸度
酸度还影响配合物的组成，Fe3+与磺基水杨酸 (Sal2-)的反应就是一个典型的例子。
pH=1.8～2.5 Fe3＋ ＋ Sal2－ ＝ Fe（Sal）＋ 紫红色
pH=4 ～ 8
pH=8 ～ 11.5 pH > 12
显色条件的选择
吸光光度法是测定显色反应达到平衡后溶液
的吸光度，为了得到准确的结果，必须从研究平 衡着手了解影响显色反应的因素，控制适当的条 件，使反应完全和稳定。
23:27:00
显色反应的主要条件
显色的主要条件有以下几点： （1）显色剂用量 显色反应一般可以用下式表示： M + R ＝ MR 为了减少反应的可逆性，根据同离子效应，加 入过量的显色剂是必要的，但过量太多，有时 会有副反应产生，反而不利。
23:27:00
3.样品室
样品室放置各种类型的吸收池 （比色皿）和相应的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻璃池两种。 在紫外区须采用石英池，可见区一 般用玻璃池。
4.检测器
利用光电效应将透过吸收池的 光信号变成可测的电信号，常用的 有光电池、光电管或光电倍增管。
5. 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行 仪器自动控制和结果处理
单色器
吸收池
检测器
显示
It A lg lg T bc I0
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
样品
23:27:00
It
注意 比较
入射光 I0
透射光 It
单波长单光束分光光度计
0.575
光源
单色器
吸收池
检测器
显示
23:27:00
单波长双光束分光光度计
光束分裂器 光源 单色器
比值
吸收池
样品池 检测器
23:27:00
信号输出
9-3显色反应及显色条件的选择
显色反应
显色反应：将待测组分转变成有颜色化合物的反应
在吸光光度分析中所用到的显色反应主要有配位反应、 氧化还原反应等。
M
R
MR
（待测组分）
（显色剂）
（有色化合物）
用于吸光光度分析的显色反应应满足下列要求： ⑴ 选择性好，干扰少； ⑵ 灵敏度高； εmax=104-105 → 灵敏度高 εmax<103 → 灵敏度低 ⑶ 有色化合物的组成恒定； ⑷ 有色化合物的性质稳定 23:27:00 ⑸ 色差大 Δλ〉60nm
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具 有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。分 光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类 可见光区：钨灯作为光 源，其辐射波长范围在320～ 2500 nm。
紫外区：氢、氘灯。发 射185～400 nm的连续光谱。
23:27:00
100
T
A
50
A=∞ T% T = 100.0 % A = 0.0 T = 36.8 %
A
0.5
0
0
C
23:26:59
A = 0.434
A Kcb
K 比例常数
吸光系数 Absorptivity c 吸光物质的浓度： g/L, mol/L 入射光波长 温度
b 吸光液层的厚度，光程，cm
物质的性质
C
23:27:00
非单色光引起的对吸光定律的偏离 设入射光由 1 和 2 两种波长组成，溶液的吸光质点对 两种波长的光的吸收均遵从吸收定律
1
2
1 + 2
I 01 A1 lg 1bc I1 I 02 A2 lg λ 2bc I2
I1 I 01 10
λ 1bc
23:26:59
吸收曲线的讨论：
①同一种物质对不同波长光的吸光度
不同。吸光度最大处对应的波长称为最
大吸收波长λ max ②不同浓度的同一种物质，其吸收曲 线形状相似λ max不变。而对于不同物质， 它们的吸收曲线形状和λ max则不同。 ③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的 依据之一。
23:27:00
吸光度与显色剂用量关系
图是吸光度与显色剂用量关系的几种情况。
图2－11吸光度与显色剂用量的关系
从三个图中可以得到： 1) 可以选用的用量较宽 2) 可以选用的用量较窄 3) 表明随着显色剂用量的增加，吸光度也不断增大。
23:27:00
（2）溶液的酸度
溶液的酸度对显色反应的影响是多方面的 : 例如由于显色剂大多是有机弱酸，酸度影 响显色剂的离解，因而影响显色剂反应的完全 程度。 又如许多显色剂本身就是酸碱指示剂，配 位反应后的颜色必须与显色剂本身的颜色有显 著的不同。 二甲酚橙pH>6.3呈红紫色，pH<6.3呈黄色， 与金属配合物则呈红色，故只适合于pH<6.3的 条件。 23:27:00
透射光栅，反射光栅；
光栅光谱的产生是多狭缝干涉与单狭缝衍射共同作 用的结果，前者决定光谱出现的位置，后者决定谱线强 度分布；
23:27:00
光栅的色散原理
23:27:00
狭缝
单色器的进口狭缝起着单色器光学系统虚光源的作用。 复合光经色散元件分开后，在出口曲面上形成相当于每条 光谱线的像，即光谱。转动色散元件可使不同波长的光谱 线依次通过。
23:27:00
基本组成总结
紫外-可见分光光度计组件
光源
单色器
氢灯，氘灯，180 ~ 375 nm； 卤钨灯，250 ~ 2000 nm. 基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定 作用：将复合光色散成单色光 棱镜 玻璃， 350 ~ 2500 nm, 石英，185 ~ 4500 nm 光栅 平面透射光栅， 反射光栅 玻璃，光学玻璃，石英 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄 像管（多道分析器） 表头、记录仪、屏幕、数字显示
第九章 吸光光度法
Spectrophotometry
9-1 吸光光度法基本原理 9-2 光度计及其基本部件 9-3 显色反应及显色条件的选择 9-4 吸光度测量条件的选择 9-5 吸光光度法的应用 9-6 紫外吸收光普法简介
23:26:59
概述
吸光光度法 是基于被测物质的分子 对光 具
有选择吸收的特性而建立的分析方法。
I 2 I 02 10 λ 2bc
λ 1 λ 2
23:27:00
I 01 I 02 I 01 I 02 A lg lg λ 1bc λ 2bc I1 I 2 I 01 10 I 02 10
A 1bc
或 或
λ 1 λ 2
h
S3 S2 S1
E3 E2 E1
A
S0 E0 纯 电子能态 间跃迁 S2
h S1 S0
23:26:59
锐线光谱 A
分子内电子跃迁
带状光谱
吸收光谱（吸收曲线）
测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为 横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化 可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。用来描述物质对不同 波长光的吸收能力。
2.单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任
波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器； ②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；
③色散元件：将复合光分解成单色光；使不同波长的辐射
以不同的角度进行传播；棱镜或光栅； ④聚焦装置：透镜或 凹面反射镜，将分光 后所得单色光聚焦至 出射狭缝； ⑤出射狭缝。
23:26:59
9-1 吸光光度法基本原理
一、物质对光的选择性吸收
10-2 nm 10 nm
射 线 x 射 线
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
103 cm
105 cm
无 线 电 波
可
见
光
23:26:59
单色光、复合光、光的互补
单一波长的光 由不同波长的光组合而成的光 若两种不同颜色的单色光按一定的强度比 例混合得到白光，那么就称这两种单色光 为互补色光，这种现象称为光的互补。
定性分析基础 物质对光的选择 吸收
A
B
A
max ( A) max ( B)
定量分析基础 在一定的实验条 件下，物质对光 的吸收与物质的 浓度成正比。
A
增 大
C
23:26:59
二、光吸收的基本定律-朗伯-比尔定律
透光率 （透射比）Transmittance
入射光 I0
透射光 It
透光率定义：
It T I0
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
全部吸收
全部透射
T = 0.0 %
T = 100.0 %
23:26:59
吸光度 与透光率 Absorbance and transmittance
lg T Kcb A
T ： 透光率
1.0
T 10
A
10
Kbc
A： 吸光度 T = 0.0 %
相互关系
23:27:00
1% E1 cm
10a 10
M
1% A E1 cm cb
吸光的加合性 多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具 有加合性，即
A
Ai ibci b i ci
i i i
主要原因 非单色光 吸光质点的相互作用
对吸收定律偏离 A
1. 比色法 2. 可见分光光度法 3. 紫外分光光度法
23:26:59
目视比色法 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分
23:26:59
标准系列
未知样品
方法简便，灵敏度高
分光光度法（紫外-可见分光光度法） UV-VIS
0.575
光源 参比 I0
单色器
吸收池
检测器
23:26:59
讨论：
④不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A
有差异，在λ max处吸光度A 的差异最大。此特性可作作
为物质定量分析的依据。
⑤在λ max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定
最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要
依据。
23:26:59
定性分析与定量分析的基础
显示
It A lg lg T bC I0
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
样品
23:26:59
It
注意 比较
入射光 I0
透射光 It
吸光光度法特点： 1）检出限低 10-5-10-6mol/L 2）灵敏度高，适于测定微量组分 3）误差2-5% 4）测定迅速、操作简单、价格便宜，应用广 泛
23:27:00
检测器
显示
双波长
将不同波长的两束单色光(λ 1、λ 2) 快速交替通过同一
吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=
1～2nm。Δ A=Aλ2-Aλ1=(ελ2-ελ1)bc=Kc
23:27:00
一、基本组成
general process
光源 单色器 样品室 检测器 显示
A 1bc
A 2bc A 2bc
非单色光引起的对吸光定律的偏离
对吸收光谱而言，b 和 c 固定，
反映了 随波长变化的情况， 单一波长，
A K i
A或
固定；不同波
长， 不同。因此，非单色光 将导致对吸光定律的偏离。
2
1
1 对应的 1较小 2 对应的 2较大
23:26:59
单色光 复合光 光的互补
黄绿 黄 橙 红
紫 紫红
光谱示意
复合光
表观现象示意
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
23:26:59
光吸收原理
物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了 物质对光的选择吸收基础。分子的紫外-可见吸收光谱是由电子 跃迁引起的，故又称电子光谱.
在实际工作中，入射光通常具有一定的带通。为了避免非单色 光带来的影响，一般选用峰值波长进行测定。 选用峰值波长，也可以得到较高的灵敏度。 23:27:00
吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离
质点间的静电作用
质点间的缔合作用
质点间的化学反应
23:27:00
9-2 光度计及其基本部件
0.575
光源 参比 I0
23:27:00
棱镜—根据光的折射现象进行分光
棱镜对不同波长的光具有不同的折射率，波长长的光， 折射率小；波长短的光，折射率大。
平行光经过棱镜后按波长顺序排列成为单色光；经聚焦
后在焦面上的不同位置上成像，获得按波长展开的光谱；
棱镜的光学特性可用色散率和分辨率来表征；
23:27:00
光栅
通过在平板玻璃或金属板上刻划出一道道等宽、等间 距的刻痕制成。常用的光栅刻痕密度每毫米为1200条、 1800条或2400条； 根据工作方式不同分为：
取值与浓度的单位相关 c：mol / L
K （或k）
摩尔吸光系数， L ·mol –1 ·cm -1
A cb
吸光系数， L ·g –1 ·cm -1
c： g / L
K a
A acb
比吸光系数 100mL ·g –1 ·cm -1
c：g / 100 mL K E1% 1cm
（2）溶液的酸度
酸度还影响配合物的组成，Fe3+与磺基水杨酸 (Sal2-)的反应就是一个典型的例子。
pH=1.8～2.5 Fe3＋ ＋ Sal2－ ＝ Fe（Sal）＋ 紫红色
pH=4 ～ 8
pH=8 ～ 11.5 pH > 12
显色条件的选择
吸光光度法是测定显色反应达到平衡后溶液
的吸光度，为了得到准确的结果，必须从研究平 衡着手了解影响显色反应的因素，控制适当的条 件，使反应完全和稳定。
23:27:00
显色反应的主要条件
显色的主要条件有以下几点： （1）显色剂用量 显色反应一般可以用下式表示： M + R ＝ MR 为了减少反应的可逆性，根据同离子效应，加 入过量的显色剂是必要的，但过量太多，有时 会有副反应产生，反而不利。
23:27:00
3.样品室
样品室放置各种类型的吸收池 （比色皿）和相应的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻璃池两种。 在紫外区须采用石英池，可见区一 般用玻璃池。
4.检测器
利用光电效应将透过吸收池的 光信号变成可测的电信号，常用的 有光电池、光电管或光电倍增管。
5. 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行 仪器自动控制和结果处理
单色器
吸收池
检测器
显示
It A lg lg T bc I0
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
样品
23:27:00
It
注意 比较
入射光 I0
透射光 It
单波长单光束分光光度计
0.575
光源
单色器
吸收池
检测器
显示
23:27:00
单波长双光束分光光度计
光束分裂器 光源 单色器
比值
吸收池
样品池 检测器
23:27:00
信号输出
9-3显色反应及显色条件的选择
显色反应
显色反应：将待测组分转变成有颜色化合物的反应
在吸光光度分析中所用到的显色反应主要有配位反应、 氧化还原反应等。
M
R
MR
（待测组分）
（显色剂）
（有色化合物）
用于吸光光度分析的显色反应应满足下列要求： ⑴ 选择性好，干扰少； ⑵ 灵敏度高； εmax=104-105 → 灵敏度高 εmax<103 → 灵敏度低 ⑶ 有色化合物的组成恒定； ⑷ 有色化合物的性质稳定 23:27:00 ⑸ 色差大 Δλ〉60nm
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具 有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。分 光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类 可见光区：钨灯作为光 源，其辐射波长范围在320～ 2500 nm。
紫外区：氢、氘灯。发 射185～400 nm的连续光谱。
23:27:00
100
T
A
50
A=∞ T% T = 100.0 % A = 0.0 T = 36.8 %
A
0.5
0
0
C
23:26:59
A = 0.434
A Kcb
K 比例常数
吸光系数 Absorptivity c 吸光物质的浓度： g/L, mol/L 入射光波长 温度
b 吸光液层的厚度，光程，cm
物质的性质
C
23:27:00
非单色光引起的对吸光定律的偏离 设入射光由 1 和 2 两种波长组成，溶液的吸光质点对 两种波长的光的吸收均遵从吸收定律
1
2
1 + 2
I 01 A1 lg 1bc I1 I 02 A2 lg λ 2bc I2
I1 I 01 10
λ 1bc
23:26:59
吸收曲线的讨论：
①同一种物质对不同波长光的吸光度
不同。吸光度最大处对应的波长称为最
大吸收波长λ max ②不同浓度的同一种物质，其吸收曲 线形状相似λ max不变。而对于不同物质， 它们的吸收曲线形状和λ max则不同。 ③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的 依据之一。
23:27:00
吸光度与显色剂用量关系
图是吸光度与显色剂用量关系的几种情况。
图2－11吸光度与显色剂用量的关系
从三个图中可以得到： 1) 可以选用的用量较宽 2) 可以选用的用量较窄 3) 表明随着显色剂用量的增加，吸光度也不断增大。
23:27:00
（2）溶液的酸度
溶液的酸度对显色反应的影响是多方面的 : 例如由于显色剂大多是有机弱酸，酸度影 响显色剂的离解，因而影响显色剂反应的完全 程度。 又如许多显色剂本身就是酸碱指示剂，配 位反应后的颜色必须与显色剂本身的颜色有显 著的不同。 二甲酚橙pH>6.3呈红紫色，pH<6.3呈黄色， 与金属配合物则呈红色，故只适合于pH<6.3的 条件。 23:27:00
透射光栅，反射光栅；
光栅光谱的产生是多狭缝干涉与单狭缝衍射共同作 用的结果，前者决定光谱出现的位置，后者决定谱线强 度分布；
23:27:00
光栅的色散原理
23:27:00
狭缝
单色器的进口狭缝起着单色器光学系统虚光源的作用。 复合光经色散元件分开后，在出口曲面上形成相当于每条 光谱线的像，即光谱。转动色散元件可使不同波长的光谱 线依次通过。
23:27:00
基本组成总结
紫外-可见分光光度计组件
光源
单色器
氢灯，氘灯，180 ~ 375 nm； 卤钨灯，250 ~ 2000 nm. 基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定 作用：将复合光色散成单色光 棱镜 玻璃， 350 ~ 2500 nm, 石英，185 ~ 4500 nm 光栅 平面透射光栅， 反射光栅 玻璃，光学玻璃，石英 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄 像管（多道分析器） 表头、记录仪、屏幕、数字显示
第九章 吸光光度法
Spectrophotometry
9-1 吸光光度法基本原理 9-2 光度计及其基本部件 9-3 显色反应及显色条件的选择 9-4 吸光度测量条件的选择 9-5 吸光光度法的应用 9-6 紫外吸收光普法简介
23:26:59
概述
吸光光度法 是基于被测物质的分子 对光 具
有选择吸收的特性而建立的分析方法。
I 2 I 02 10 λ 2bc
λ 1 λ 2
23:27:00
I 01 I 02 I 01 I 02 A lg lg λ 1bc λ 2bc I1 I 2 I 01 10 I 02 10
A 1bc
或 或
λ 1 λ 2
h
S3 S2 S1
E3 E2 E1
A
S0 E0 纯 电子能态 间跃迁 S2
h S1 S0
23:26:59
锐线光谱 A
分子内电子跃迁
带状光谱
吸收光谱（吸收曲线）
测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为 横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化 可得一曲线，此曲线即为吸收光谱。用来描述物质对不同 波长光的吸收能力。
2.单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任
波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器； ②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；
③色散元件：将复合光分解成单色光；使不同波长的辐射
以不同的角度进行传播；棱镜或光栅； ④聚焦装置：透镜或 凹面反射镜，将分光 后所得单色光聚焦至 出射狭缝； ⑤出射狭缝。
23:26:59
9-1 吸光光度法基本原理
一、物质对光的选择性吸收
10-2 nm 10 nm
射 线 x 射 线
102 nm 104 nm
紫 外 光 红 外 光
0.1 cm 10cm
微 波
103 cm
105 cm
无 线 电 波
可
见
光
23:26:59
单色光、复合光、光的互补
单一波长的光 由不同波长的光组合而成的光 若两种不同颜色的单色光按一定的强度比 例混合得到白光，那么就称这两种单色光 为互补色光，这种现象称为光的互补。
定性分析基础 物质对光的选择 吸收
A
B
A
max ( A) max ( B)
定量分析基础 在一定的实验条 件下，物质对光 的吸收与物质的 浓度成正比。
A
增 大
C
23:26:59
二、光吸收的基本定律-朗伯-比尔定律
透光率 （透射比）Transmittance
入射光 I0
透射光 It
透光率定义：
It T I0
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
全部吸收
全部透射
T = 0.0 %
T = 100.0 %
23:26:59
吸光度 与透光率 Absorbance and transmittance
lg T Kcb A
T ： 透光率
1.0
T 10
A
10
Kbc
A： 吸光度 T = 0.0 %
相互关系
23:27:00
1% E1 cm
10a 10
M
1% A E1 cm cb
吸光的加合性 多组分体系中，如果各组分之间无相互作用，其吸光度具 有加合性，即
A
Ai ibci b i ci
i i i
主要原因 非单色光 吸光质点的相互作用
对吸收定律偏离 A
1. 比色法 2. 可见分光光度法 3. 紫外分光光度法
23:26:59
目视比色法 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低（半定量） 不可分辨多组分
23:26:59
标准系列
未知样品
方法简便，灵敏度高
分光光度法（紫外-可见分光光度法） UV-VIS
0.575
光源 参比 I0
单色器
吸收池
检测器
23:26:59
讨论：
④不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A
有差异，在λ max处吸光度A 的差异最大。此特性可作作
为物质定量分析的依据。
⑤在λ max处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定
最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要
依据。
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定性分析与定量分析的基础
显示
It A lg lg T bC I0
未考虑吸收池和溶剂对光子的作用
样品
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It
注意 比较
入射光 I0
透射光 It
吸光光度法特点： 1）检出限低 10-5-10-6mol/L 2）灵敏度高，适于测定微量组分 3）误差2-5% 4）测定迅速、操作简单、价格便宜，应用广 泛
23:27:00
检测器
显示
双波长
将不同波长的两束单色光(λ 1、λ 2) 快速交替通过同一
吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=
1～2nm。Δ A=Aλ2-Aλ1=(ελ2-ελ1)bc=Kc
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一、基本组成
general process
光源 单色器 样品室 检测器 显示
A 1bc
A 2bc A 2bc
非单色光引起的对吸光定律的偏离
对吸收光谱而言，b 和 c 固定，
反映了 随波长变化的情况， 单一波长，
A K i
A或
固定；不同波
长， 不同。因此，非单色光 将导致对吸光定律的偏离。
2
1
1 对应的 1较小 2 对应的 2较大