功能基因组学

学检测不典型，根据相关检查，诊断为AML（acute
myeloid leukaemia, 急性骨髓白血病），治疗几个月后未见 好转。后来用DNA芯片与病人骨髓的mRNA杂交，结果显 示AML和ALL(acute lymphoblastic leukaemia 急性成淋巴细胞 白血病)基因都表达较低，而在数据分析中发现，编码原肌
球蛋白的基因表达极高，从而确诊为肺泡弹状肌肉瘤，改
变治疗方案，病情出现缓解。
RNAi（RNA interference，RNA干扰） 通过反义RNA与正链RNA形成双链RNA特 异性抑制靶基因的转录后表达的现象，存在于 从低等的线虫到人类培养细胞等多种有机体。 RNAi相关技术是研究转录后调控的有效工 具，可用于功能基因组学研究以及基因治疗等 临床用途。
DNA芯片的基本原理

基因芯片技术是建立在Southern blot基础之上的，可
以说它是Southern blot的改进和发展，它的原理是：
变性DNA加入探针后在一定温度下退火，同源片段之 间通过碱基互补形成双链杂交分子。
基因芯片基本操作流程

制备总RNA mRNA经RT-PCR用Cy3（正常对照组） 和Cy5（实验组）荧光标记目的基因，得到cDNA探针 混合标记探针 与表达谱芯片上核苷酸片 段（或基因）杂交 扫描 分析杂交结果 结论
库序列比较,可以提供内含子结构,可选择剪切方式,转录起
始和终止位点等信息。
EST的应用

分离和鉴定新基因
将所获得EST用生物信息学方法与公共数据库中的已 知序列比对,可以迅速准现有价 值的EST,可以找到对应的克隆,获得的全长cDNA可以直接 用于转基因等研究。利用EST方法进行发现、分离基因的

转录图的分析（Transcriptional map）
分离纯化mRNA或cDNA比较分析蛋白质
的编码能力，使人们有可能系统、全面地从 mRNA水平了解特定细胞、组织或器官的基因 表达模式，并解释其生理属性，深入认识细胞 生长、发育、分化、衰老和疾病发生的机制。

序列图分析（sequence map） 测定由30亿个核苷酸组成的全部序列。 人类基因组的核苷酸序列图其实是分子水平 上最高层次，最详尽的物理图。

通过简单的方法将这些标签串联在一起，形成大 量多联体（concatemer），对每个克隆到载体的多 联体进行测序，并应用SAGE软件分析，可确定表 达的基因种类，并可根据标签出现的频率确定基 因的表达丰度（abundance）。
SAGE 步骤
1. 将5μg含有oligo dT（引物）的磁珠与 RNA混合。 2. 合成双链cDNA。 3. 用NlaⅢ酶消化形成一条链末端有标签 的产物。


以SNPs为基础研究人类疾病
遗传学家寻找致病基因的基本策略是：连锁分析和关
联分析。
连锁分析是确定两个遗传标记或者更多遗传标记
之间的物理关系，以确定致病基因的位置。
关联分析是研究某种遗传标记与某一特定表型的之间
的关系
表达序列标签（Expressed sequence tags, EST）
功能基因组学
20世纪人类科技史上的三大创举
90年代人类基因组计划
60年代人类首次登上月球 40年代第一颗原子弹爆炸
一、基因组学概念及范畴
基因组(genome)
泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部
遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色
体（单倍体）DNA。 基因组学(genomics) 是指发展和应用DNA制图、测序新技术以 及计算机程序，分析生命体（包括人类）全部基
较基因组学研究的重要内容。
EST的应用

用于制备cDNA芯片
芯片技术,是目前高通量筛选EST的有效方法。随着更 多基因组计划的开展和更多已知功能基因的积累,将来无需 进行测序,只通过DNA芯片技术就可以研究基因的功能。 EST计划的实施不仅获得了关于表达基因的信息资源同时 也获得了大量已经经过功能鉴定了的cDNA克隆资源而这
RNAi 机制模式图
RNA干扰技术
核心技术： siRNA（ Small interfering RNA）的设 计与合成 siRNA的标记


siRNA的转染
RNAi的检测（核酸及蛋白水平）
siRNA的设计
因组结构及功能。
基因组学包括3个不同的亚领域 结构基因组学(structural genomics)
功能基因组学(functional genomics)
比较基因组学(comparative genomics) 基因组学概念
结构基因组学
• 结构基因组学(structural genomics)是通过人类 基因组计划HGP的实施来完成的。 • HGP的内容就是制作高分辨率的人类遗传图和 物理图，最终完成人类和其它重要模式生物全 部基因组DNA序列测定，因此HGP属于结构 基因组学范畴。
异。
EST的应用

基因的定位克隆
以EST为重要来源的染色体物理图谱进一步方便了对 抗病基因的连续分析,可将抗病基因定位在染色体中的狭小 区段,缩小抗病基因的筛选范围。同时,EST标记是功能序列 区的标记,处于目标基因的范围内,是目标基因的编码区,因 此EST标记是分离功能基因的有效标签,大大提高了克隆基
基因芯片
基因芯片的应用

特定基因检测 突变检测 多态性分析 基因表达谱
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生物信息学的工具 基因相关性研究 基因功能 药物设计和开发 潜在反义试剂开发 个体化医疗 身份识别 基因诊断 其他与生物有关的领域
例：肿瘤诊断

国外有一临床病人表现出典型的白血病症状，但形态
二、后基因组学的研究（Postgenome era）
人类基因组计划完成之后，生物学被重新划分为前基
因组和后基因组两部分。
科学研究已开始进入“后基因组时代”。主要是开展
功能基因组学和蛋白质组学的研究。
有科学家形象地说道：即使基因测话簿。“后基因 组时代”的最终目标，是要把深奥的DNA语言变成一 本大基因百科全书。
ESTs是从已建好的cDNA中随机取出一个克隆， 从5’末端或3’末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自 动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。
EST的应用

构建遗传学图谱
遗传图谱、物理图谱和转录图谱,是基因组计划要获得 的3张遗传学图谱。构建染色体物理图谱需要大量的单拷贝 短序列作为界标,由于大多数基因是单拷贝的,所以可以用 EST序列充当序列标签位点(STS)。而且,由于EST序列是转 录基因的产物,可用来直接构建遗传连锁图,通过与基因组文
因的效率。
EST的应用

比较基因组学的研究
利用EST序列中古老保守序列来研究生物中间的进化 关系,可以避免选择家系、构建群体、大量的统计分析等周 期,长而繁琐的遗传图谱的制作过程。此外,利用基因组较小 的模式生物所获得的已知功能基因,用复杂基因组生物,如人 和动植物的EST比较,从而推测,待测EST的功能,已经成为比
SAGE实例
DNA芯片

DNA芯片（DNA chip）也叫基因芯片（Gene chip）

是指在固相载体（玻璃，硅等）上有序地，高密度地
（点间距小于500μm）排列固定了大量的靶基因或寡
核苷酸（也叫探针）。这些被固定的分子探针在基质 上形成高密度的DNA微阵列，因此DNA芯片又叫 DNA微矩阵（DNA Microarray）
功能基因组学


功能基因组学，后基因组学(Post genomics)： 利用结构基因组学提供的信息和产物 通过在基因组或系统水平上全面分析基因的 功能 生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转 向对多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。 功能基因组学的目的 基因功能发现 基因表达分析及突变检测 从基因组整体水平上对基因的活动规律进行 阐述。
4. 将样品分成两份，连接成含有识别序 列的产物，以备用BsmF1消化。 5. 用Mme I切割每一个样品形成约60bp 的标签。
6. 延伸5秒，连接成约130bp的双链标 签。
7. PCR扩增。
8. 用Nla Ⅲ酶切130bp产物释放34bp双链 标签。
9. 连接片断形成串联体。
10. 克隆到pZErO-1+里，并测序。
些资源都是功能基因组研究所不可缺少的。
SAGE （serials analysis of gene expression） 基因表达系列分析 1995年，JohsHopkins大学的分子肿瘤 学家Kinzler和Vogelstein及其同事建立 了SAGE方法.
SAGE 技术的主要理论依据：

来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列 （9~11bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信 息，可作为区别转录物的标签（tag）；
人类基因组计划（HGP）的研究内容
遗传图的分析（Genetic
map）
确定基因或DNA标记在染色体上的相对
位置与遗传距离

物理图的分析（Physical map） 以已知核苷酸序列的DNA片段（序列 标签位点）为路标，以碱基对作为基本测量 单位（图距）的基因组图。将各种标记直接 定位在基因库中的某个位点上。
RNAi 研 究 史
十几年前，Rich Jorgensen 在 矮牵牛花中发现转基因沉默 七年前，researchers Guo 和Kemphues 注入 反义RNA及正义链RNA都能抑制线虫par-1 基因的表达；三年后，Fire等注入双链RNA 到线虫中发现比注入单链更有效，随后发展 了通过RNAi进行线虫基因敲除的策略。 近年来，显微注射，基因枪，基因工程手段诱 导RNAi也成为果蝇研究中的反向遗传学工具。 2001年Elbashir等《 Nature》上首次报道 通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动 物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随 后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。

蛋白质组学（双向电泳—质谱）
单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP)
定义
单核苷酸多态性是指基因组DNA中某一特定核苷 酸位置发生了转换，颠换，缺失和插入等变化而引起 的序列多态性，而且任何一等位基因在群体中的频率 不小于1%。
SNPs在GC序列上出现最为频繁，以C-T最多见。 据估计SNPs在人类基因组的平均密度为1/1000，数量
研究,不仅是人类基因组研究的热点,而且也是模式生物基因
研究的重要内容。
EST的应用

基因差异表达的研究
通过比较不同发育和空间 的基因表达的发育顺序谱。因为一个基因表达的峰度越高, 它被随机调或器官中表达的差

单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphisms,SNP）
中英联合实验室
SNPs与表型

编码区内的SNPs可能改变氨基酸残基的种类，这 可以直接影响蛋白质的功能； 外显子和内含子相连部位的SNPs可能改变外显子 一内含子的剪接，影响蛋白质的修饰； 在调控区域内的SNPs可以改变mRNA的表达水平 和稳定性。
巨大，因此多态性信息含量高。
DNA（分子）标记

限制性片段长度多态性（restriction fragment length
polymorphisms,RFLP）

简单序列长度多态性（simple sequenece length polymorphisrns,SSLPs)

小卫星序列：（Minisatellite DNA） 微卫星序列：（Microsatellite DNA, MS）
1、功能基因组学的研究内容

基因功能的研究 基因组的表达及时空调控的研究 蛋白质组及蛋白质组学的研究 基因组多样性的研究

模式生物体的基因组研究
2、功能基因组学的研究方法

单核苷酸多态性（SNPs）分析


表达序列标签（ESTs）分析
基因表达的序列分析（SAGE）


DNA芯片
RNA干扰