磷酸化蛋白的研究进展

多学科的相互渗透和研究技术手段的高速发展，生命科学在20世纪取得了巨大的进步。特别是在基因组研究方面已取得了许多的成果，包括人类基因组在内的多种生物的基因组全序列测定已陆续完成，面对庞大的遗传信息，人们开始关注这些序列信息与生命活动之间的直接或间接的联系。基因的功能是什么？它们又是如何发挥这些功能的？

蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文介绍了蛋白质磷酸化定义、修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质鉴定技术、检测方法并综述了近年来国内外的主要研究进展。

蛋白质磷酸化：指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。

磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类，即:O-磷酸盐、N-磷酸盐、酰基磷酸盐和S-磷酸盐。O-磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的,如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸,羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化仍不清楚；N-磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；而S-磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成。

蛋白质磷酸化具有以下功能:

(1) 磷酸化参与酶作用机制,在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S-或N-磷酸盐) ,如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统( PTR) 的组氨酸蛋白激酶(HPr) 。

(2) 磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化,如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残基) 或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基) 。

(3) 天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。

[32 P]放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法。体内代谢培养用[32P]标记磷酸盐作为磷酸基团供体,被[32P]标记的蛋白质进行一维或二维凝胶电泳分离,用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。磷蛋白酸水解产物用二维磷酸肽作图法分析可以确定蛋白质的磷酸化氨基酸类型。磷蛋白水解肽段经HPLC分离,通过监测放射性活度收集到磷酸肽,用Edman测序或串联质谱分析都可以确定磷酸化位点,当然这需要有足够量的磷蛋白用于分析。早在1991年, Arrigo等就采用[32P]代谢标记和二维凝胶电泳分析的方法观察了细胞在耐热处理后再经热刺激和肿瘤坏死因子刺激后热休克蛋白hsp28磷酸化程度的变化,发现耐热处理后细胞在热刺激和肿瘤坏死因子刺激下所引起的hsp28的磷酸化程度会显著降低。[32P]放射性标记可以非常灵敏、直观地检测磷蛋白,尤其是与二维凝胶电泳结合后可以从蛋白质组的角度整体观察细胞内蛋白质磷酸化程度的变化,它的缺点是不能标记组织样本,并且存在放射性污染的问题。

Pro2Q Diamond是Molecular Probes公司近年新推出的一种磷酸化蛋白质的荧光染料。通过荧光扫描仪检测可以直接显示出一维或二维凝胶电泳胶上分离的磷酸化蛋白质,对非磷酸化蛋白质的反应性很低,荧光强度会随着蛋白质磷酸化程度的不同而呈现出一定的量的变化。该染料可以与其它检测总蛋白的荧光染料配合使用,同时展示出胶上的总蛋白谱和磷酸化蛋白谱。这种染料还与质谱兼容,胶上的蛋白质点可以通过胶上酶切进行质谱鉴定。但是对于磷酸化程度不同的磷蛋白检测的灵敏度是不同的,对于有5个磷酸化位点的β酪蛋白可以检测到1～2 ng的量,有一个磷酸化位点的胃蛋白酶可以检测到8 ng的量。该方法在研究磷酸化蛋白质的差异表达谱方面有一定的应用前景。

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