细胞转染
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（1）逆转录病毒
（2）腺病毒
四 转染后筛选
• 筛选所选用的抗生素跟转染所用的质粒上 所带的真核筛选抗性基因有关的 。
• 标有neo（实际上应该是neo resistance） 的载体，指载有降解新霉素的基因，新霉 素作用于原核和真核细胞，对两者都有杀 伤作用。用于转染后，稳定表达外源基因 细胞的阳性筛选。
• 3 载体DNA
• 一般原则：对纯化所得的载体进行质量鉴 定。确定维持其正常功能的基因序列是否 适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的 参数时，一定要选用一种已知具有功能的 载体做对照。
• （1）载体完整性
• （2）载体制备物
• 4 组织培养试剂
• 一般原则：优化您的细胞生长条件。只使 用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能 减少所用试剂的变更。
A. 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元 件:
a.启动子 b.增强子 c. 多聚腺苷酸化信号 d. 药物选择 标记基
e. 报告基因 f.表位标签
B.常用的哺乳动物表达质粒载体 a. pcDNA3.l b. pSI c. pCMV-HA d. pBudCE4.1 e. pTRE
2Baidu Nhomakorabea病毒型载体
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之 一。DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带 负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。 DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开 始，但用于稳定转染却不可靠。
(2). 磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于 瞬时转染和稳定染的研究。方法是，先将 DNA和氯化钙混合，然后加人到PBS中慢慢 形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬 液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作 用摄人DNA。
2）若构建DNA重组体是为了克隆某个基因， 可进行在序列测定。
（3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。
基因转染真核细胞的方法
转染方 法
化学 转染法
物理 转染法
病毒 感染法
DEAE一 葡聚糖 法
磷酸钙 法
人工 脂质体 法
显微 注射 法
电穿孔 法 基因枪 法 逆转录病毒
腺病毒
(1).DEAE-葡聚糖
b. 构建RT/PCR文库法获取未知基因
据mRNA末端如polyA尾设计共同引物 → 将所用 mRNA 并逆转录成 cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 → 采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体 → 构成PCR－cDNA文库筛选
C.计算机克隆－即利用GenBank信息，利用不 同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因 片段，这有赖于各种计算机软件的应用。
• (1)基础培养基 • (2)胎牛血清 • (3)添加剂
• 5 转染方案
• 一般原则：建立一套适当的转染方案；首 先从一种标准方案开始，然后通过改变试 剂/DNA的配比和复合物的剂量进行优化。
• （1）转染复合物的制备
• （2）转染试剂/DNA配比（负载比）
• （3）转染复合物的加入
• （4）形成转染复合物所用的稀释剂
D.化学合成法制备基因片段－用DNA合成仪， 对目的基因分段合成，连接，可以得到所需 的目的基因。
2.哺乳动物细胞表达载体的选择
哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒 型载体
（1）质粒型载体
哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质 粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病 毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。
• （3）.脂质体介导法（目前应用最广泛）
• 【原理】：阳离子脂质体试剂与DNA混合 后，形成一种稳定的脂质双层复合物， DNA被包在脂质体中间，这种脂质双层复 合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘 附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释 放到胞浆中。
• 此图所示是脂质体介导转染的示意图，它 显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳 动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载 体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应 用的病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒 和杆状病毒等。
A．逆转录病毒载体
逆转录病毒的优点是，可以使外源基因整合到基 因组中，因而可以被稳定传代和表达。但是，由于逆 转录病毒的插入位点是随机的，因而在基因组内的整 合有可能破坏一些内源基因的结构，尤其是当插人到 一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。
• 【主要应用】:瞬时转染 稳定转染
• 【特点】：使用方法简单，可携带大片段 DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA， 能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。 虽在体外基因转染中有很高的效率，但在 体内，能被血清清除，并在肺组织内累积， 诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性， 很大程度上应用受限制。
瞬时转染
稳定转染
目的
快速分析
为获得稳定表达外 源基因的单细胞克 隆
目的DNA与宿主
未整合
整合
染色体
表达持续时间
随细胞分裂而稀释 随宿主细胞本身基 至丢失48－72小时 因组一样复制，转
录，翻译，并被稳 定遗传
筛选办法
抗生素抗性
抗生素抗性
三、转染的方法
• 基因转染的基本方法可以分为： • （1）重组子的构建 • （2）基因转染真核细胞的方法
组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。
• b. 从真核基因组DNA制备 • c.从已克隆的DNA片段制备
B. PCR或RT/PCR方法制备目的基因
a. 获取已知基因 据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知）
→ 设计/合成一对引物 → PCR（基因组DNA为模板） /RT-PCR(mRNA为模板) → 从组织或细胞制备目的 基因
重组子的构建
1.目的基因的制备和获取 2. 哺乳动物细胞表达载体的选择 3. DNA片断的重组连接 4. DNA重组体的鉴定
1.目的基因的制备和获取
(1)目的基因 是所要研究或应用的基因，也就是将要
克隆或表达的基因或基因的一个片段 (2)目的基因常用的制备方法
• A.限制酶切除 • a.从原核基因组DNA制备－视原核基因
（3）基因枪法
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核 酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞 和在体的细胞。
病毒颗粒是一类十分有效的基因释放系统， 因此，它是将外源基因导人大量细胞最有效的 方法。病毒感染具有高效率、可稳定遗传、适 用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。 但多数病毒有其潜在的危险性，操作者需要有 一定的病毒操作经验和良好的设施。
B.腺病毒载体
易于培养、纯化，在感染过程中复制与 转录依赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较 大的外源基因片段，且腺病毒基因不会发 生整合，是研究真核基因的良好模型。
3.DNA片断的重组连接
粘端连接方法要点
平端连接方法要点
①单酶单切点 防自身环化， ①平端，平端连接；
希望定向插入；
②Linker连接酶切产生粘端连接；
• 1 细胞 • （1）分裂细胞相比较非分裂细胞 • （2）贴壁细胞相比较悬浮细胞 • （3）传代次数 • （4）细胞数量（融合率）
• 2 交叉污染
• 如果同一个实验室同时培养不同种类的细 胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循 最严格的分离操作规程这种情况也有可能 发生。如有许多细胞系被HeLa细胞所污染。 和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通 过镜检发现。如果有少量某种生长快速的 细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们 就会完全取代目标培养物。
利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其 形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于 瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞， 重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率 的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到 能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平 衡点。
(2）显微注射法
该法虽然费力，但却是非常有效的将核 酸导人细胞或细胞核的方法。这种方法常用 来制备转基因动物，但不适用于需要大量转 染细胞的研究。
基因转染
导师：谭晖 学生：王娟
报告内容
• 一 转染的简介 • 二 转染的分类 • 三 转染的方法 • 四 转染后筛选
一 、 转染的简介
1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或 运送到细胞内并使核酸在细胞内维持 其生物功能。
2.基因转染技术已广泛应用于基因组功 能研究和基因治疗研究。
二 、转染的分类
③Adaptor衔接目的基因和载体；
②双酶双切点 定向克隆，构
④同源同聚尾，克隆cDNA的最好
建表达载体的最好用此法； 方法
③利用同裂解酶产生相同粘 ⑤T载体，PCR产物T/A克隆法连
端。
接
4. DNA重组体的鉴定
外源DNA片断是否插入载体构成重组DNA分子，而 插入片断大小，是否突变及插入位置，顺序及方 向则关系到构建载体是否扩增，我们所需要的基 因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴 定DNA重组体
• 当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷 酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而 能在含有G418的选择性培养基中生长。目 前G418的这一特性已在基因转移，敲除， 抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛 应用。
• 转染是否成功的影响因素很多，如需要转 染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如 此），需要被转染的分子（DNA、RNA、 寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。但无 论在何种情况下，转染的成功均取决于转 染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要 素。
• 标有amp（实际上应该是amp resistance） 的载体，指载有降解氨苄青霉素的基因（β －内酰胺酶），作用于原核细胞，只对敏 感菌有作用。用于克隆菌的筛选。
• 最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 。G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
• G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对 原核和真核细胞等都有毒性，包括细菌， 酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原生 动物和蠕虫。细菌Tn5转座子序列（neo抗 性基因）携带的氨基糖苷类磷酸转移酶可 以将G418转变成无毒性状。
（1） 酶切鉴定是必需的，基于下述: A. 限制性 图谱个 体特异 性 ，不 同的载 体或
DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样， 电泳图谱不一样。
B. 同一载体连接不同的DNA片断，不同的载 体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不 同的 。
C. 插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点) 酶切，一般来说用3种限制酶切： ①可鉴定载体及 ②插入片段的大小,方 向,切后并电泳分析,以确定是否得到预期 的rDNA。
• 6 时间进度
• 一般原则提示：要确保最终结果的成功； 建立一个合适的时间进度进行转染实验以 保证您所需要的目的蛋白能得到最佳表达。
• （1）转染的开始 • （2）培养基更换 • （3）时间测定
谢谢指导！
• 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒 性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度 以及转染的时间长短和培养基中血清的含 量都是影响转染效率的重要问题，通过实 验摸索的合适转染条件对于效率的提高有 巨大的作用。
• 此图为脂质体转染后荧光蛋白的表达
物理方法
包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。
（1）电穿孔法
（2）腺病毒
四 转染后筛选
• 筛选所选用的抗生素跟转染所用的质粒上 所带的真核筛选抗性基因有关的 。
• 标有neo（实际上应该是neo resistance） 的载体，指载有降解新霉素的基因，新霉 素作用于原核和真核细胞，对两者都有杀 伤作用。用于转染后，稳定表达外源基因 细胞的阳性筛选。
• 3 载体DNA
• 一般原则：对纯化所得的载体进行质量鉴 定。确定维持其正常功能的基因序列是否 适合于您的细胞体系。在测定细胞体系的 参数时，一定要选用一种已知具有功能的 载体做对照。
• （1）载体完整性
• （2）载体制备物
• 4 组织培养试剂
• 一般原则：优化您的细胞生长条件。只使 用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能 减少所用试剂的变更。
A. 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元 件:
a.启动子 b.增强子 c. 多聚腺苷酸化信号 d. 药物选择 标记基
e. 报告基因 f.表位标签
B.常用的哺乳动物表达质粒载体 a. pcDNA3.l b. pSI c. pCMV-HA d. pBudCE4.1 e. pTRE
2Baidu Nhomakorabea病毒型载体
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之 一。DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带 负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取。 DEAE一葡聚糖转染已成功地应用于瞬时开 始，但用于稳定转染却不可靠。
(2). 磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于 瞬时转染和稳定染的研究。方法是，先将 DNA和氯化钙混合，然后加人到PBS中慢慢 形成DNA磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬 液加到培养的细胞上，通过胞膜的内吞作 用摄人DNA。
2）若构建DNA重组体是为了克隆某个基因， 可进行在序列测定。
（3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。
基因转染真核细胞的方法
转染方 法
化学 转染法
物理 转染法
病毒 感染法
DEAE一 葡聚糖 法
磷酸钙 法
人工 脂质体 法
显微 注射 法
电穿孔 法 基因枪 法 逆转录病毒
腺病毒
(1).DEAE-葡聚糖
b. 构建RT/PCR文库法获取未知基因
据mRNA末端如polyA尾设计共同引物 → 将所用 mRNA 并逆转录成 cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 → 采用一对共用引物扩增所有cDNA，插入适当载体 → 构成PCR－cDNA文库筛选
C.计算机克隆－即利用GenBank信息，利用不 同种属同源性设计引物，尝试获取未知基因 片段，这有赖于各种计算机软件的应用。
• (1)基础培养基 • (2)胎牛血清 • (3)添加剂
• 5 转染方案
• 一般原则：建立一套适当的转染方案；首 先从一种标准方案开始，然后通过改变试 剂/DNA的配比和复合物的剂量进行优化。
• （1）转染复合物的制备
• （2）转染试剂/DNA配比（负载比）
• （3）转染复合物的加入
• （4）形成转染复合物所用的稀释剂
D.化学合成法制备基因片段－用DNA合成仪， 对目的基因分段合成，连接，可以得到所需 的目的基因。
2.哺乳动物细胞表达载体的选择
哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒 型载体
（1）质粒型载体
哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质 粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病 毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。
• （3）.脂质体介导法（目前应用最广泛）
• 【原理】：阳离子脂质体试剂与DNA混合 后，形成一种稳定的脂质双层复合物， DNA被包在脂质体中间，这种脂质双层复 合物可直接加到培养的细胞中，脂质体粘 附到细胞表面并与细胞膜融合，DNA被释 放到胞浆中。
• 此图所示是脂质体介导转染的示意图，它 显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
病毒型载体已被广泛地用于将外源基因导入哺乳 动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因，这类载 体将来在基因治疗中将具有非常重要的价值。目前应 用的病毒类型包括：逆转录病毒、腺病毒、牛痘病毒 和杆状病毒等。
A．逆转录病毒载体
逆转录病毒的优点是，可以使外源基因整合到基 因组中，因而可以被稳定传代和表达。但是，由于逆 转录病毒的插入位点是随机的，因而在基因组内的整 合有可能破坏一些内源基因的结构，尤其是当插人到 一些重要的基因位点时会导致细胞的异常。
• 【主要应用】:瞬时转染 稳定转染
• 【特点】：使用方法简单，可携带大片段 DNA，通用于各种类型的裸露DNA或RNA， 能转染各种类型的细胞，没有免疫原性。 虽在体外基因转染中有很高的效率，但在 体内，能被血清清除，并在肺组织内累积， 诱发强烈的抗炎反应，导致高水平的毒性， 很大程度上应用受限制。
瞬时转染
稳定转染
目的
快速分析
为获得稳定表达外 源基因的单细胞克 隆
目的DNA与宿主
未整合
整合
染色体
表达持续时间
随细胞分裂而稀释 随宿主细胞本身基 至丢失48－72小时 因组一样复制，转
录，翻译，并被稳 定遗传
筛选办法
抗生素抗性
抗生素抗性
三、转染的方法
• 基因转染的基本方法可以分为： • （1）重组子的构建 • （2）基因转染真核细胞的方法
组物理图谱已知或未知，克隆方法不同。
• b. 从真核基因组DNA制备 • c.从已克隆的DNA片段制备
B. PCR或RT/PCR方法制备目的基因
a. 获取已知基因 据已发表的基因序列（或基因两侧序列已知）
→ 设计/合成一对引物 → PCR（基因组DNA为模板） /RT-PCR(mRNA为模板) → 从组织或细胞制备目的 基因
重组子的构建
1.目的基因的制备和获取 2. 哺乳动物细胞表达载体的选择 3. DNA片断的重组连接 4. DNA重组体的鉴定
1.目的基因的制备和获取
(1)目的基因 是所要研究或应用的基因，也就是将要
克隆或表达的基因或基因的一个片段 (2)目的基因常用的制备方法
• A.限制酶切除 • a.从原核基因组DNA制备－视原核基因
（3）基因枪法
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核 酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞 和在体的细胞。
病毒颗粒是一类十分有效的基因释放系统， 因此，它是将外源基因导人大量细胞最有效的 方法。病毒感染具有高效率、可稳定遗传、适 用于各种不同来源的细胞及操作简单等优点。 但多数病毒有其潜在的危险性，操作者需要有 一定的病毒操作经验和良好的设施。
B.腺病毒载体
易于培养、纯化，在感染过程中复制与 转录依赖于宿主细胞的聚合酶，可插入较 大的外源基因片段，且腺病毒基因不会发 生整合，是研究真核基因的良好模型。
3.DNA片断的重组连接
粘端连接方法要点
平端连接方法要点
①单酶单切点 防自身环化， ①平端，平端连接；
希望定向插入；
②Linker连接酶切产生粘端连接；
• 1 细胞 • （1）分裂细胞相比较非分裂细胞 • （2）贴壁细胞相比较悬浮细胞 • （3）传代次数 • （4）细胞数量（融合率）
• 2 交叉污染
• 如果同一个实验室同时培养不同种类的细 胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循 最严格的分离操作规程这种情况也有可能 发生。如有许多细胞系被HeLa细胞所污染。 和其他细胞系之间的交叉污染不总是能通 过镜检发现。如果有少量某种生长快速的 细胞掺入到培养细胞种，几个月过后它们 就会完全取代目标培养物。
利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其 形成利于核酸进人的微孔。电穿孔技术可用于 瞬时转染和稳定转染，可方便地用于悬浮细胞， 重现性好，但需要较多的细胞。影响转染效率 的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到 能够使核酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平 衡点。
(2）显微注射法
该法虽然费力，但却是非常有效的将核 酸导人细胞或细胞核的方法。这种方法常用 来制备转基因动物，但不适用于需要大量转 染细胞的研究。
基因转染
导师：谭晖 学生：王娟
报告内容
• 一 转染的简介 • 二 转染的分类 • 三 转染的方法 • 四 转染后筛选
一 、 转染的简介
1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或 运送到细胞内并使核酸在细胞内维持 其生物功能。
2.基因转染技术已广泛应用于基因组功 能研究和基因治疗研究。
二 、转染的分类
③Adaptor衔接目的基因和载体；
②双酶双切点 定向克隆，构
④同源同聚尾，克隆cDNA的最好
建表达载体的最好用此法； 方法
③利用同裂解酶产生相同粘 ⑤T载体，PCR产物T/A克隆法连
端。
接
4. DNA重组体的鉴定
外源DNA片断是否插入载体构成重组DNA分子，而 插入片断大小，是否突变及插入位置，顺序及方 向则关系到构建载体是否扩增，我们所需要的基 因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴 定DNA重组体
• 当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷 酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而 能在含有G418的选择性培养基中生长。目 前G418的这一特性已在基因转移，敲除， 抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛 应用。
• 转染是否成功的影响因素很多，如需要转 染的细胞类型（对于困难的细胞系尤其如 此），需要被转染的分子（DNA、RNA、 寡核苷酸、蛋白质），转染试剂等。但无 论在何种情况下，转染的成功均取决于转 染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要 素。
• 标有amp（实际上应该是amp resistance） 的载体，指载有降解氨苄青霉素的基因（β －内酰胺酶），作用于原核细胞，只对敏 感菌有作用。用于克隆菌的筛选。
• 最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 。G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
• G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对 原核和真核细胞等都有毒性，包括细菌， 酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原生 动物和蠕虫。细菌Tn5转座子序列（neo抗 性基因）携带的氨基糖苷类磷酸转移酶可 以将G418转变成无毒性状。
（1） 酶切鉴定是必需的，基于下述: A. 限制性 图谱个 体特异 性 ，不 同的载 体或
DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样， 电泳图谱不一样。
B. 同一载体连接不同的DNA片断，不同的载 体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不 同的 。
C. 插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点) 酶切，一般来说用3种限制酶切： ①可鉴定载体及 ②插入片段的大小,方 向,切后并电泳分析,以确定是否得到预期 的rDNA。
• 6 时间进度
• 一般原则提示：要确保最终结果的成功； 建立一个合适的时间进度进行转染实验以 保证您所需要的目的蛋白能得到最佳表达。
• （1）转染的开始 • （2）培养基更换 • （3）时间测定
谢谢指导！
• 利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒 性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度 以及转染的时间长短和培养基中血清的含 量都是影响转染效率的重要问题，通过实 验摸索的合适转染条件对于效率的提高有 巨大的作用。
• 此图为脂质体转染后荧光蛋白的表达
物理方法
包括电穿孔、显微注射及基因枪等方法。
（1）电穿孔法