关于-细胞自噬的相关研究方案成果

关于细胞自噬的相关研究成果

姓名：陶宗学院：化学化工学院专业：化学学号：16010601001

2016年度诺贝尔生理学与医学奖刚揭晓不久，获奖者为日本科学家大隅良典

(Yoshinori Ohsumi )，以奖励他在“细胞自噬机制方面的发现”。

一、概述

细胞自噬这是细胞组分降解与再利用的基本过程。“自噬”(autophagy) —词源于希腊语前缀“ auto- ”，意为“自我”，以及另一个希腊语单词“ phagein ”，意为“吞

食”。因此，自噬作用的意思非常明确，那就是“自我吞噬”。

“自噬”的概念由比利时科学家Christian de Duve 在1963年溶酶体国际会议上首

先提出，是指一些需降解的蛋白质和细胞器等胞浆成分被包裹，并最终运送至溶酶体降解的过程，自噬性降解产生的氨基酸和其他一些小分子物质可被再利用或产生能量。现已明确，自噬的主要功能之一实际上是在细胞受到应激性的死亡威胁时保持细胞的存活，这是真核细胞维持稳态、实现更新的一种重要的进化保守机制。虽然广义上的自噬包括巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chapeon-mediated autophagy) 三种类型，通常所说的自噬即指巨自噬，也是目前研究

最多的。对这一过程开展研究非常困难，这也就意味着我们对其知之甚少。

直到上世纪1990年代，在经过一系列出色的实验之后，日本科学家大隅良典利用的研究更新了我们关于细胞物质循环的旧有观点，他的研究开启了理解自噬作用在许多生理过程中关键作用的崭新道路，如生物体对于饥饿的适应或者机体对于感染的反应。自噬基因的突变会导致疾病的发生，自噬作用机制在一些类型的疾病，如癌症和神经疾病等病症中也发挥了作用。

面包酵母找到了与自噬作用有关的关键基因随后他开始致力于阐明酵母菌体内自噬作

用的背后机制，并发现与之相似的复杂过程

也同样存在于我们人类的细胞内。大隅良典

我们人体的细胞内部拥有很多不同功能的细胞器，而溶酶体只是其中的一种，其内部含有能够消化自身细胞器的特殊酶。在细胞体内还能观察到大量存在的，被称作“吞噬小体”的特殊囊体。随着吞噬小体的形成，它会不断包裹细胞内部物质，如那些受损的蛋白质和其他细胞器。最后，这些小体会与溶酶体相结合，这一机制为细胞提供了营养与物质更新的途径。

20世纪70年代至80年代，研究人员主要专注于研究另一套用来降解蛋白质的系统，即“蛋白酶体” (proteasome) 。在该研究领域，阿龙- 切哈诺沃(Aaron Ciechanover) 、阿夫拉姆-赫什科(Avram Hershko)和美国科学家欧文-罗斯(Irwin Rose)被授予2004年诺贝尔化学奖，以表彰他们在泛素调节的蛋白质降解研究领域中的卓越成就。蛋白酶体虽然能有效地逐步降解蛋白质，但该机制仍未能解释细胞是如何消除大型蛋白质复合物和受损的细胞器。

二、细胞自噬的研究方法目前，人们对自噬的检测主要包括基于检测自噬体的直接(观察自噬体的形态)和间接(检测自噬体表面蛋白标记)的方法以及基于自噬性降解原理设计的一些方法。除此之外，还可通过对自噬通路的调控来全面评价自噬功能对细胞行为或机体功能的影响，如自噬抑制或激活剂、自噬相关基因的敲除及沉默等。近年来，一些自噬基因缺陷的动物模型及体内自噬活性分析方法的建立使得自噬研究设计更为合理、结果更具有说服力。

需要特别指出的是，在有些文献上能看到通过一些荧光染料(如lysotracker 、monodansylcadaverine 、acridine orange )标记的方法检测溶酶体的数量和活力来反映自噬，目前认为这种方法缺乏特异性，不能够代表自噬的出现。此外，还有检测一些自噬相关蛋白（如Beclin-1 、Atg5 ）的mRNA 及蛋白质水平表达的方法，实际上，这也不能够反映自噬的激活，

因为在自噬过程中，这些蛋白的激活表现在其翻译后的修饰以及蛋白间的相互作用，而并不是表达量的增加．在对待以上两种方法得出的结论时需理性看待，避免盲从。

（一）自噬性结构的电镜下形态学观察——自噬检测的金标准透射电子显微镜

是观察自噬现象的最直接、最经典的方法。电镜检测自噬主要是基于辨认自噬体结构，半个世纪前科学家就借助电镜最先观察到了自噬体结构。自噬体通常是双层膜结构包含着未消化的胞浆成分或细胞器（如线粒体、内质网片段），并未与溶酶体融合。电镜下自噬体内容物的形态和电子密度与胞浆中的一致，因此容易识别。自噬体融合成自噬溶酶体后，则变成单层膜结构，其中含有降解不同阶段的胞浆成分。一般来说，降解的物质电子密度会增加，形成黑色颗粒状或不定形的聚集，因此也能够辨认［1-2］。只是对于晚期自噬溶酶体无法识别内容物质的来源。在实际操作的时候，如没有特殊的标记是难以区分自噬体、自噬内涵体和自噬溶酶体等不同成熟阶段结构的，因此，只能根据其内容物的结构完整情况大致用初始自噬囊泡（AVi）和降解自噬囊泡（AVd）来表示，其中AVi内含的胞浆物质结构完整，AVd内容物则被不同程度降解［3巴（二）基于自噬体标记蛋白LC3 的检测方法自噬过程由一系列自噬相关蛋白（Atg 蛋白）介导完成，这些蛋白质在自噬体形成的不同阶段发挥作用。微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3/Atg8 ）是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在两种形式的LC3蛋白：LC3- I和LC3- Ho LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割变成LC3- I, LC3- I

散在分布于细胞浆内。当自噬体形成后，LC3- I和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE ）偶联形成LC3- U并定位于自噬体内膜和外膜。与其他一些定位于自噬性结构膜上的Atg 蛋白不同（仅在自噬过程的某一阶段发挥作用）LC3- U始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体的标记，且LC3- U的水平在某种程度上反映了自噬体的数量⑸。

（三）基于自噬性降解的检测——“自噬潮”分析

自噬过程是动态变化的，而自噬体仅是整个自噬通路过程中的一个中间结构。要说明细胞自噬活性的强弱，必须通观整个自噬的过程是否顺利，即通过基于自噬性降解的自噬潮（autophagic flux ）分析来进一步说明自噬活性。自噬潮是一个动态连续的概念，涵盖了自噬体的形成、自噬性底物向溶酶体的运送以及在溶酶体内降解的整个过程。显然，对这整个过程进行监测较单纯自噬体检测更能反映自噬活性，因此“自噬潮”分析是反映自噬活性的可靠指标[6]。

（四）自噬的实验性调控

通过人为的干预来激活或者抑制自噬功能后观察细胞行为或效应分子的变化能够

使研究结论更具有说服力。目前，实验性激活或者抑制自噬的方法有药物处理、自噬基因敲除、沉默或过表达。常用的抑制自噬及诱导自噬的药物及机制如表 1 所示。这些工具药普遍存在的缺陷就是特异性不强，在抑制自噬的同时对细胞其他代谢过程也可能会有影响。如3-MA抑制Class川PI3K的同时对Class I PI3K同样也有抑制作用，继而

抑制Akt/mTOR 通路，激活自噬