全血分离获得血清的方法及步骤

全血分离获得血清的方法及步骤

材料与方法

1.1 血清采集MG患者全血来自2004～2005年就诊于辽宁中医学院附属医院的门诊患者。根据典型临床表现、新斯的明试验、低频重复电刺激及单纤维肌电图等确诊，无其他自身免疫性疾病，未经其他免疫抑制治疗，并参照1994年版《中医病证诊断疗效标准》辨证为脾肾虚型。正常人血清取自同时期健康志愿者。-70 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.2 主要试剂固相pH梯度干胶条IPG strip（Amersham公司产品，非线性pH 3～10，7 cm）。3-〔3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基〕丙磺酸盐｛3-〔（3-cholamidopropyl）dimethylamino〕-1-propanesul-fonate，CHAPS｝，二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol，DTT），三丁基膦（tributyl phosphine，TBP），尿素，硫脲，碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA），丙烯酰胺（acrylamide）、甲双丙烯酰胺（N，N'-methylenebi-sacrylamide），四甲基乙二胺（N，N，N，N-tetram-ethyl-ethylenediamine，TEMED），过硫酰胺（am-monium persulfate，APS），三羟甲基氨基甲烷〔tris （hydroxymethyl）aminomethane〕、甘氨酸（glycine，Gly）和十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）均为Bio-Rad公司产品。琼脂糖为华美生物公司产品。其他试剂均使用国产分析纯试剂。所有溶液均用MilliQ水配制。

1.3 主要仪器高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品;EttanTMIPGphorⅡ，Amersham Biosci-ences公司产品;P-2000分光光度仪，Hitachi公司产品;SE-600电泳仪，Amersham公司产品;纯水装置，Millipore公司产品;GS-710光密度扫描仪，Bio-Rad公司产品;冷却水循环系统，Cole-Parmer公司产品;Bruker-Daltonics AutoFlex TOF-TOF LIFTMass Spectrometer，美国Bruker-Daltonics公司产品;LCQ Deca XP Plus，美国Thermo Finnigan公司产品。

1.4 双向电泳

1.4.1 血清总蛋白质的提取及定量血清-70 ℃反复冻融4次后，用Agilent Multiple Affinity Re-moval Column处理去除高丰度蛋白。使用Agilent 5K超滤管进行浓缩除盐，冻干回收的样品，-70 ℃保存。用裂解液（9 mol/L 尿素、4% CHAPS、65 mmol/L DTT和cocktail酶抑制剂）进行复溶，并采用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量。

1.4.2 等电聚焦自-20 ℃取出的胶条，室温下平衡10 min，以500 μg上样量在每份样本中加入上样缓冲液（8 mol/L尿素、2% CHAPS、1% Bio-lyte和1% TBP）以及标准蛋白质分子，上样于泡胀槽中，加入矿物油覆盖。程序设置如下:30 V 12 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，8 000 V 6 h。恒温20 ℃。等电聚焦电泳后IPG胶条在平衡液1（Tris-base 50 mol/L 、尿素6 mol/L、甘油30%、SDS 2%、溴酚蓝0.002%和DTT 100 mg）中于振荡器上振荡15 min; 然后置入平衡液2（成分同平衡液1，用400 mg 碘乙酰胺代替100 mg DTT）同样于振荡器上振荡15 min。

1.4.3 SDS-PAGE垂直电泳采用1

2.5%的均匀SDS2聚丙烯酰胺凝胶（水2

3.2 ml，30%丙烯酰胺溶液32.46 ml，1.5 mol/L Tris-HCl缓冲液pH 8.8 20 ml，10% SDS 0.8 ml，10% APS 0.4 ml，TEMED 3.76 μl，胶总体积80 ml）。将平衡后的IPG胶条移至凝胶的上方，胶条一端放入低分子量蛋白质标准，0.5%的琼脂糖封胶。上下槽加入电极缓冲液（Tris 5 mmol/L，Gly 192

mmol/L和SDS 0.1%）。初始电流为每块胶40 mA，电泳20 min，然后以每块胶60 mA电流，直至溴酚蓝前沿。

1.4.4 银染色电泳结束后，采用硝酸银染色法，通过固定，硝酸银染色，显影，停显及脱色，至背景清晰。

1.5 图像分析每个样品常规进行3次二维电泳，用GS-710光密度扫描仪对电泳后的胶图分别进行扫描，所得扫描图像输入计算机，采用Image-master软件对图像进行背景消减、蛋白质点检测和校正，获取蛋白质点的位置坐标和表达量等分析。选取Ratio ≥1.5的蛋白质点认为有差异。所有数据的统计分析均采用SPSS 1

2.0软件，统计学分析采用t 检验。

1.6 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析用手术刀片切下胶上目标条带，进行切胶、胶上胰蛋白酶酶解20 h ，抽提酶解肽段，Zip Tip脱盐后点样，行基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）分析（飞行管长

2.7 m，加速电压20 kV ，反射电压23 kV）。将第1级质谱得到的肽片段质量指纹图谱、肽质量指纹图谱与第2级质谱得到的肽序列信息一起用来检索蛋白质数据库，找出匹配的蛋白质。

1.7 数据库检索将质谱鉴定所得的肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting，PMF）数据于Bio-Works（Thermo Finnigan，San Jose，CA）软件搜索相应的库。搜索使用的数据库为IPI human蛋白库（SEQUEST结果过滤参数为:当Charge+1，Xcorr≥1.9;当Charge+2，Xcorr≥

2.2;当Charge+3，Xcorr≥

3.75;其中DelCN≥0.1）以及NCBI上Homo sapiens的非冗余蛋白库（redundant data-base）。检索参数为胰蛋白酶解;氨基酸固定修饰方式为脲甲基半胱氨酸;模式为单同位素峰;肽片断最大误差控制在100 ppm;肽片断最大分子量误差为±0.5 Da;每个肽允许有1个不完全裂解位点。

2 结果

2.1 脾肾虚型重症肌无力患者血清双向电泳图谱的建立及分析经2-DE技术及银染色后，得到了两组血清的双向凝胶电泳图，并于相同的条件下重复实验3次。在正常对照组细胞蛋白质组双向电泳图谱上可观察到 1 463±179个蛋白点，而脾肾虚型重症肌无力组可见到1 508±89个蛋白点