哈佛大学分子生物学DNA复制(第三讲)
分子生物学Chapter 3 DNA 复制PPT课件
1984，Blackburn, E.研究组发现四膜虫rDNA末端在小核阶段 没有重复片段 ，但在发育成大核后rDNA末端出现了 370~520bp的（GGGGTT）n的重复序列。-- 推测在发育过程 中添加了此重复序列。该推测通过加尾实验验证。
.
3.2.3 D-环复制 （D-loop Model）
（线粒体DNA）
.
D-环复制的特征
环状DNA模板的两条单链的复制起点位置不同且相距 甚远。
复制起始首先在一条单链的复制起点起始，单向、连 续合成前导链，并置换另一条模板单链。
当另一条单链的复制起点暴露后，起始后随链的单向、 连续的合成。
colidna双向复制coli低剂量的tdttp的培养基数分钟高剂量的tdttp的培养基数分钟提叏ecolidnaecolidna放射自显影对丌同复制模式的预期结果实际观测结果ecolidna的复制是双向的复制起点的结构特征ecoli的复制起点oric不其它细菌的复制起点的序列比较以ecoli的复制起点ori13bpdrdirectionalrepeat
端粒酶（端粒末端转移酶 Telomere terminal transferase）: 真核生物特有的维持端粒完整性的酶，含有特定的小分子RNA 分子。
.
3’ 3’ 3’ 3’
.
当端粒酶催化合成足够长的G链后，G链回折形成Hoogsteen 结构，且末端和另一链的末端连接，形成封闭的染色体末端。
末端重复一致。
但是，四膜虫末端重复的互补序列在上述体系中不能加尾。
末端的延长是DNA合成过程， 原有的序列是合成的. 引物而不是模板。
3.3DNA的复制课件高一下学期生物人教版必修2(2)
细胞分裂一次
离心
提 取DNA
F1
提 取DNA
离心
F2
—
密度
低
高
15N/15N一DNA
DNA 半复制的实验证据
提取DNA
离
心
转移到4NH₄Cl的培养液 中
细胞分裂一次
离心
F1
提 取DNA
提 取DNA
离心
F2
→
密度
低
高
15N/15N-DNA
DNA 半复制的实验证据
15N/15N-DNA
14N
15N/14N-DNA
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正指
《核酸的分子结构》论文节选
对DNA 的推测——全保留复制 DNA复制以DNA双链为模板，子代DNA的双链都是 新合成的。
全保留复制
对DNA 的推测——半保留复制
DNA复制时，DNA 双螺旋解开，互补的碱基之间 的氢键断裂，解开的两条单链分别作为复制的模 板，游离的脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则， 通过形成氢键，结合到作为模板的单链上。
作业布置
3、将DNA双链都被15N标记的大肠杆菌放在含有14N的培养基中培养，使其分裂3
次，下列叙述正确的是
()
A. 所有的大肠杆菌都有15N B. 含有15N的大肠杆菌占全部大肠杆菌的比例为1/2 C.含有15N的大肠杆菌占全部大肠杆菌的比例为1/4
D.含有15N的大肠杆菌占全部大肠杆菌的比例为1/8
DN A 的 复 制 也 是 在 这 个 时 期 完 成 的 。
()
作业布置
2、DNA复制保证了亲子代间遗传信息的连续性。 下列关于DNA复制的叙述，正确
的是
()
A. 复制均在细胞核内进行 B. 碱基互补配对原则保证了复制的准确性 C.1 个DNA分子复制1次产生4个DNA分子
分子生物学中的 DNA 复制过程
分子生物学中的 DNA 复制过程DNA复制是生命的基本过程之一。
它是分子生物学中的一个重要领域。
DNA复制过程指的是DNA分子的双链分离并将其复制成新的DNA分子。
正因为DNA复制过程的重要性，它也成为了生命科学领域研究的热点问题之一。
1. DNA分子的结构特点DNA是由一系列的核苷酸构成的分子。
每个核苷酸包括一个糖分子、一个磷酸基团和一个碱基。
磷酸基团和糖分子连成一条链，而碱基则通过氢键连结在链的两端上。
DNA分子由两条互补的链构成，这些互补链是通过碱基之间的氢键相互连接。
因此，DNA分子被描述为双链螺旋结构。
2. DNA复制的意义DNA复制是基因传递的基础。
如果某一细胞的DNA不能被复制，则它的子代将无法获得与父代相同的基因信息。
在有性繁殖中，DNA复制是保证每个新生个体都有正确基因组的关键。
另外，DNA复制还是生长和细胞分裂的必要过程。
每当细胞分裂时，DNA都需要被分裂成两份，然后在分裂后形成两个新的细胞。
3. DNA复制的过程DNA复制是由一系列酶催化的反应组成的。
以下是DNA复制的主要步骤：1）起始点的建立DNA复制起始于一个起始点。
在这个点上，DNA由特定的酶分离成两条单链。
这个起始点通常位于染色体中的特定区域。
2）拉开DNA双链拉开DNA双链是接下来的重要步骤。
这也是由酶催化的反应完成的。
这些酶被称为螺旋酶（helicases）。
它们能够加速DNA螺旋分离，从而形成单链的DNA 模板。
3）合成RNA引发剂在DNA复制的过程中，一个 RNA 引发剂会帮助其他酶合成新的DNA链。
该酶被称为原始 RNA 引发剂，它能够与DNA结合，并通知DNA聚合酶在适当的位置停下。
4） DNA聚合酶合成新链DNA聚合酶是单链DNA复制的至关重要部分。
它在模板链上逐步合成新链，并保证其与模板精确匹配。
该酶随后向前移动，持续合成新链，直到完成整个复制过程。
5）证实精度DNA聚合酶进行拼接后，还有其它DNA修复酶负责检查DNA的拼接是否正确无误，并修复错误，以确保新的DNA相对于原DNA的镜像无压力。
分子生物学第三章-dna的复制-the replication of dna-2019
4. The Replication Fork（复制叉） 5. DNA Synthesis at the Replication Fork（复制叉上的
DNA合成） 6. Initiation of DNA Replication（复制的起始） 7. Binding and Unwinding（结合和解旋） 8. Finishing Replication（复制的终止）
Fingers （手指）
Thumb（拇指）
Palm （手掌）
DNA聚合酶的3个结构域：拇指，手指，手掌
DNA Polymerase-palm domain(手掌域）
1. Contains two catalytic sites, one for addition of dNTPs and one for removal of the mispaired dNTP.
3. 3. Exonuclease site/proof reading site（校对功能，外切 核酸酶活性位点）
DNA Polymerase-finger domain（手指域）
Binds to the incoming dNTP, encloses the correct paired dNTP to the position for catalysis（手指域中 的几个残基可以和引入的dNTP结合，一旦形成正确的 碱基配对后，手指域即发生移动，包围住dNTP）
Processivity（延伸能力） is a characteristic of enzymes that operate on polymeric substrates（酶 处理多聚体底物的一种特性）
分子生物学dna复制过程
分子生物学dna复制过程嘿，朋友！咱们来聊聊这神奇的分子生物学里的 DNA 复制过程。
你知道吗？DNA 就像是生命的密码本，而复制它就像是给这个密码本做备份。
想象一下，细胞要生长、分裂，没有新的密码本怎么行？DNA 复制开始的时候，就好像一场精心编排的舞蹈。
两条链先慢慢解开，就像解开一对相互缠绕的麻花。
然后，一些特别的酶跑过来，它们就像是熟练的工匠，找准位置，开始工作。
其中一个关键的角色叫解旋酶，这家伙力气可大啦！它使劲把两条链分开，让复制能够开始。
这就好比你要打开一个紧紧封闭的盒子，得先把盖子撬开一样。
分开之后，会形成一个像小叉子一样的结构，叫复制叉。
在复制叉这里，又有新的角色登场啦。
DNA 聚合酶就像是一群勤劳的小蜜蜂，它们沿着解开的链，一个碱基一个碱基地添加新的伙伴。
这可不能随便乱加，得严格按照碱基配对的原则来，A 配 T，G 配 C，错了可不行！这复制的过程可不是一帆风顺的，也会遇到一些小麻烦。
比如说，有时候会出现错误配对，这就像是在盖房子的时候放错了砖头。
不过别担心，还有纠错的机制呢，就像有监理在旁边监督，发现错误马上纠正。
随着复制的进行，新的链一点点变长，就像织毛衣一样，一针一线，慢慢成形。
一条链是连续合成的，另一条链呢，是一段一段合成，然后再连接起来，是不是很神奇？等到复制完成，新的 DNA 分子就产生啦！这不就像是复制出了一本新的密码本，细胞可以拿着它去开启新的生命旅程。
你说这 DNA 复制是不是超级厉害？它保证了生命的遗传信息能够准确传递，让生命的延续变得有条不紊。
咱们得感叹生命的奇妙啊，这么精细又复杂的过程，就在我们身体里每时每刻地进行着！所以说，了解 DNA 复制过程，就是在探索生命的奥秘深处。
哈佛大学分子生物学讲义Replication3A
late G1
MCM
S
MCM
"Pre-Replicative Complex"
early G1 M G2
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ORC
Eukaryotic initiation complex
ORC : A six subunit protein complex which has been implicated as being the eukaryotic DNA replication initiator protein. Subunits are named according to their size, with ORC1 being the largest and ORC6 being the smallest subunit. Yeast ORC specifically binds to replication origins in an ATP dependent manner and has been shown to possess ATPase activity. CDC6/Cdc18 : An essential factor for the assembly of the prereplicative complexes that co-operates with Cdt1 to load MCM2-7 Proteolyzed in yeasts or exported out of the nucleus in mammalian cells at the G1- S transition. Overexpression of Cdc6 in yeast causes multiple rounds of DNA replication without intervening mitosis, making it a critical regulator of DNA replication. MCM2-7 : A family of six related proteins (MCM2-MCM7) which seem to function together in a large multi-subunit protein complex. The role of MCMís in DNA replication is still speculative, ranging from mediation of protein-DNA interactions to DNA helicase activity.
分子生物学中的DNA复制和基因表达机制
分子生物学中的DNA复制和基因表达机制生命的奥秘一直是人类探索的重要课题之一。
而生命的最基本单元是细胞，而细胞内的一切活动，都是由一种称为DNA的分子所主导的。
如何进行DNA的复制和基因表达，就成为了分子生物学中的两大重要研究方向。
本文将从DNA复制和基因表达机制两方面加以讲述。
一、DNA复制除了分裂期，细胞在其生命周期中需要不断地进行DNA复制，以使后代细胞可以得到遗传信息的准确传递。
DNA复制是一个复杂的过程，一般可以分为四个步骤：解旋、配对、延伸和连接。
1. 解旋在开始DNA复制的过程中，首先需要进行DNA的解旋。
这个过程由解旋酶完成，该酶能够打开DNA的双链结构，形成两股分开的单链DNA。
在解旋过程中，也需要涉及到其他一些辅助蛋白，如单链结合蛋白，它能够帮助单链DNA保持长达1000个碱基的长度。
2. 配对在解旋后，DNA双链结构上的两条单链DNA需要进行配对。
这个过程由DNA聚合酶完成，它能够匹配新合成的核苷酸与DNA模板链上的核苷酸，形成新的单链DNA。
这个过程中，DNA聚合酶需要依赖于DNA模板链上的氢键进行结合。
3. 延伸一旦新的单链DNA形成后，就需要进一步进行延伸。
这需要依赖于DNA聚合酶能够从其活性中心进行核苷酸的加成，因此，DNA聚合酶也被称为DNA合成酶。
对于真核生物，DNA合成酶分为α和ε两类，分别承担不同的功能，如α可以在每个核子体上建立新的DNA分子，而ε能够准确地识别损伤的DNA，并进行修复。
4. 连接在延伸完成的单链DNA与模板链的配对形成后，还需要进行连接。
这个过程由连接酶完成，它能够将新合成的单链DNA与原DNA模板链上的DNA片段连接起来。
连接酶在这个过程中还要消耗大量的三磷酸腺苷（ATP）。
二、基因表达基因表达是指在细胞内将基因信息转录成RNA，进而合成蛋白质的过程。
这个过程可以分为三个步骤：转录、剪切和翻译。
1. 转录转录是基因表达的第一步，该过程中，RNA聚合酶通过识别DNA模板链上的起始序列，开始沿着DNA链进行单链RNA的自下而上合成。
哈佛大学分子生物学翻译(第三讲)
– Large structural change between GTP- and GDP-bound form
• EF1B (EF-Ts)
– 30 kDa – GEF for EF1A
• EF2 (EF-G)
– 77 kDa protein – GTP and GDP are bound with similar affinities
bond formation • P-site is the position where is transferred to during peptide-bond formation and where it stays until it moves to the exit site • E-site is the spot where the tRNA is placed after it is detached from the growing peptide chain
Recap: What are A, P and E sites on ribosome
• Sites in the interface between large and small ribosomal subunits where tRNAs reside during protein synthesis • A-site is the position where the amino-acid tRNA sits prior to peptide
Step 3: Movement of small subunit relative to mRNA
Conformational changes place two tRNAs bound to mRNA into E- and P- sites of small particle
分子生物学 第三章 DNA的复制PPT课件
复制过程中首先两条链间的氢键破裂并使双链
解旋和分开，然后以每条链为模板，按碱基互
补配对原则(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合
成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条
链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA
分子的碱基序列完全相同。在此过程中，每个
子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则
是新合成的。这种复制方式称此过程中，每个
37
(三)DNA复制的终止
❖ 过去认为，DNA一旦复制开始，就会将该 DNA分子全部复制完毕，才终止其DNA复制。 但最近的实验表明，在DNA上也存在着复制 终止位点，DNA复制将在复制终止位点处终 止，并不一定等全部DNA合成完毕。
Meselson等证明DNA的半保留复制
6
复制起点和复制子
❖ DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定
位置开始。这个特定的位置就称为复制起点
(Origin of replication)，用ori表示。DNA复制 从起点开始双向进行直到终点为止，每一个 这样的DNA单位称为复制子或复制单元 (replicon)。
12
Okazaki fragment 1968 Reiji Okazaki
3‘ （semi-discontinuous replication ! ）
5‘
3‘
5‘
DNA replication in Okazaki fragment 1kb At least one strand of DNA replication in Okazaki fragment 1kb13
26
❖ 为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢? 这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。 DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差 错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也 要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的 准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ 催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加 在RNA引物3&#点
分子生物学课件DNA的复制
DNA聚合酶VIII：负责 复制DNA链，参与 DNA复制
DNA聚合酶X：负责复 制DNA链，参与DNA
复制
DNA聚合酶I：负责修 复DNA损伤，参与 DNA复制
DNA聚合酶III：负责 复制DNA链，参与 DNA复制
DNA聚合酶V：负责复 制DNA链，参与DNA
复制
DNA聚合酶VII：负责 复制DNA链，参与 DNA复制
全过程
调控机制：细胞周期与DNA复 制的调控机制主要包括细胞周 期蛋白依赖性激酶（CDK）和
细胞周期蛋白（Cyclin）
细胞周期蛋白（Cyclin）：与 CDK结合形成复合物，调控细
胞周期进程
DNA复制的启动和终止
启 动 ： 需 要 特 定 的 启 动 子 序 列 ， 如 TATA 盒 和 C A AT 盒 终 止 ： 需 要 特 定 的 终 止 子 序 列 ， 如 T TA G G 和 TA A G G 调控机制：包括正调控和负调控，如转录因子、DNA结合蛋白等 复制过程：包括DNA解旋、引物合成、DNA聚合酶作用等步骤
复制速度：通过复制速率调控因子控制复制速度 复制方向：通过复制方向调控因子控制复制方向
复制保真性：通过复制保真性调控因子控制复制保真性 复制调控网络：通过复制调控网络调控DNA复制的各个
环节
Part Five
DNA复制的异常与 疾病
DNA复制异常的原因
基因突变：DNA复制过程中发生错误，导致基因突变 染色体异常：染色体数目或结构异常，影响DNA复制 环境因素：辐射、化学物质等环境因素影响DNA复制 遗传因素：家族遗传性疾病，影响DNA复制
分子生物学课件DNA的 复制
,
汇报人：
目录
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ01 添 加 目 录 项 标 题
分子生物学课件之DNA复制
2021/7/20
（1）DNA聚合酶的5'→3'聚合活性
2021/7/20
这是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的 核 苷 酸 顺 序 ， 将 互 补 的 dNTP 逐 个 加 到 引 物 RNA3’-OH 末 端 ， 即 促 进 3'-OH 与 dNTP 的 5'PO4形成磷酸二酯键，酶的专一性表现为新进入的 dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用， 5'→3'聚合活性存在于klenow片段上。 DNA聚合 酶I的延伸能力不强，每次与模板－引物结合仅能添 加20～100个核苷酸。
2021/7/20
2021/7/20
然后，DnaC催化DnaB蛋白解环，并套在单链DNA 上。在DnaB和DnaC蛋白复合体中，DNA解旋酶保 持非活性状态。DNA解旋酶的安装导致装载因子从 复合体中释放出来，并激活DNA解旋酶。DNA解旋 酶向前运动，在其身后留下单链DNA模板。
2021/7/20
2021/7/20
2021/7/20
2021/7/20
四、DNA的半不连续复制
2021/7/20
在复制叉处，DNA的两条链都作为模板同时合成 两条新链。DNA分子的两条链是反向平行的 ，而 DNA复制时无论以那条链做模板，新合成的链是按 5’→3’方向进行的，所以只有一条模板链指导合 成的新生链能够沿着复制叉运动的方向连续复制，此 新合成的链称为前导链（leading strand）。另一 条模板链指导合成的新生链也是沿5’→3’方向进 行，但与复制叉前进的方向相反，是分段合成的，这 些片断于1969年首先在大肠杆菌中分离出来，被称 为冈崎片段。
2021/7/20
2021/7/20
分子生物学第三章DNA的复制知识总结
分子生物学第三章DNA的复制知识总结.doc分子生物学第三章：DNA的复制知识总结引言DNA复制是生物体细胞分裂过程中的一个关键步骤，确保遗传信息的准确传递给下一代细胞。
在分子生物学的第三章中，我们深入探讨了DNA 复制的机制、参与的酶类、复制过程以及复制后的修复机制。
本文将对这些内容进行详细的总结。
第一节：DNA复制的基本概念1.1 DNA复制的定义DNA复制是指在细胞分裂前，DNA分子精确复制自身，生成两份相同的DNA分子的过程。
1.2 DNA复制的重要性遗传信息的传递：确保子代细胞获得与亲代相同的遗传信息。
细胞增殖：为细胞分裂提供必要的遗传物质。
1.3 DNA复制的特点半保留复制：每个新生成的DNA分子都包含一个原始链和一个新合成的链。
高度保守：在不同的生物体中，DNA复制的基本机制相似。
第二节：DNA复制的酶类和蛋白质2.1 DNA聚合酶功能：在DNA复制中添加新的核苷酸，形成新的DNA链。
类型：包括DNA聚合酶I、II、III等。
2.2 解旋酶功能：解开DNA双链，为复制提供模板。
2.3 SSB蛋白功能：保护解开的单链DNA，防止其结构被破坏。
2.4 引物酶功能：合成RNA引物，为DNA聚合酶提供起始点。
第三节：DNA复制的过程3.1 起始阶段解旋酶在复制起点处解开DNA双链。
引物酶合成RNA引物。
3.2 延伸阶段DNA聚合酶III沿着模板链添加核苷酸，合成新的DNA链。
两条新链分别在前导链和滞后链上合成。
3.3 终止阶段当复制达到DNA末端时，复制过程终止。
RNA引物被移除，由DNA聚合酶I填补。
第四节：DNA复制的调控4.1 复制的起始点特定的DNA序列作为复制的起始点。
4.2 复制的调控蛋白多种蛋白质参与调控复制过程，确保复制的准确性和效率。
4.3 复制的周期性细胞周期中，DNA复制发生在特定的时期。
第五节：DNA复制的修复机制5.1 错配修复修复复制过程中发生的碱基错配。
5.2 核苷酸切除修复移除并替换受损的核苷酸。
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Sequence that when added to a non-replicating DNA causes it to replicate; this approach was used to identify Autonomously Replicating Sequences (ARS) in yeast.
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Sequence that when mutated causes a replicating DNA to fail to replicate; this approach was used to identify essential elements in an (ARS) in yeast
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1) In synchronously replicating cells, density transfer experiments can reveal which sequences replicate earliest. What is the direction of fork movement here?
Genes on a chromosome
% of probe in HL DNA L
A
B
C
100 C 0 B A
Time
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2) Electron microscopy of bubbles after restriction enzyme digestion
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Early genes : proteins essential for viral DNA replication
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T antigen binding sites cluster around the ori
(HU for oriC)
PriB PriC DnaT
Helicase Priming
DnaB/DnaC Primase
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SV40: a polyomavirus that is very useful for studying eukaryotic replication enzymes
Characteristics used to define Origins of Replication
* The position on the DNA at which replication start points are found. (4 methods discussed) * A DNA sequence that when added to a non-replicating DNA causes it to replicate. * A DNA sequence whose mutation abolishes replication. * A DNA sequence that in vitro is the binding target for enzyme complexes known to function in initiation of DNA replication.
T Antigen from cell lysate + baculovirus expression system PC 0.2 M KCl QS 0.2 M KCl ssDNA 0.6 M KCl 1 M KCl RPA
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0.66 M KCl (RF-C, pol α + pol δ)
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SV40 ori
Li & Kelly SV40 DNA replication In vitro. PNAS (1984) 81:6973
COS cells (infected with SV40) (expresses T Ag) + plasmid + dNTP + rNTP + α32PdATP 37o C, 60 min Analyze products by electrophoresis and autoradiography SV40 + ori +
What else could they do to validate their system?
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Fractionation to homogeneity
COS cells (infected with SV40) (expresses T Ag) Human HeLa or 293 cells
PCN A Lig1 ?
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Yeast containing Leu2 on a plasmid Grow under non-selective conditions Plate yeast on Leucine minus plates to estimate rate of plasmid loss
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Upper strand A fragments B C D
Lower strand fragments
E
F
G
H
Nascent DNA used to probe DNA fragments: A B C D
E
F
G
H
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4) 2D Gel electrophoresis of replication intermediates followed by hybridization with a DNA fragment reveals whether a replication bubble originates in the fragment
5'-3' polymer a se P O III CO R E 3'-5' exonuclease L 5'-3' exonuclease MPLE X γ CO β CLA M P LIG A S E DnaB ATP dependent clamploader processivity factor seal nicks Helicase
OriC in E. coli chromosomal DNA
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Initiation of DNA replication in E. coli
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DnaA and oriC independent replication initiation in E. coli from hairpins, D-loops and R loops
Two primosomes for E. colte of primosome assembly oriC, A-site n'-pas, D-loop, R-loop
Recognition
DnaA protein
PriA protein
Auxilliary proteins for loading helicase
0.4 M KCl (PCNA)
ELONGATION FACTORS ARE CONSERVED
Pr okaryotic SSB PR IMA S E Function ss D NA c oating R N Aprimer s ynth. Euka r yotic RPA Pr imase subunit of D N AP O α, L D N APOL α, D N APOL δ D N APOL δ Fen1 RF-C
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Properties of SV40 T antigen
* * * * * *
98% nuclear: NLS origin-specific DNA binding DNA independent ATPase ATP dependent DNA helicase Binds to DNA polymerases, AP2, p53, Rb Undergoes phosphorylation etc.
BamHI EcoRI
BamHI
EcoRI
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3) Hybridizing lagging strand nascent DNA to strand-specific fragments shows site of switch from leading to lagging strand synthesis
Linker scanning mutations in yeast ARS1
Examples of mutants WT-ARS1
B3
B2
B1
A
% URA+ colonies
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