怎样选择色谱柱液相色谱柱的种类与方法开发文稿演示
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Type B：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅 烷）水解/烧结/酸洗
杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱
样品分子直径小于平均孔 径，才能进入微粒内部
孔径至少是样品流体学直 径的4倍
300Ǻ孔径用于：超过50个 氨基酸的肽或25个残基的低 聚寡核苷酸
样品分子直径小于平均孔径， 才能进入微粒内部
柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II
条件： C8色谱柱，4.6×150mm， 3.5um，
A溶剂，0.1%TFA水溶液； B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈－
1、 色谱柱的构型 • 色谱柱内径 • 色谱柱长度
2、 固定相柱填料 • 粒径 • 比表面积 • 孔径 • 孔隙率 • 基质表面特性： - 表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 - 耐碱性 • 键合类型 - 官能团、是否封尾 - 键合相的保留行为、耐酸性
色谱柱的构型对色谱柱性能的影响
色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径 色谱柱尺寸 对色谱分离的影响：
颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高.
柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积
每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间
增加(梯度洗脱尤为注意) 根据需要选择合适的比表面积
柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I
多孔材料的95%以上表面 在孔内部
怎样选择色谱柱液相色谱柱的种类与方法开发文稿演示
（优选）怎样选择色谱柱液相 色谱柱的种类与方法开发
色谱基本概念回顾
色谱（chromatography）
色谱原理 色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）
；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能：分析（种类/定量），纯化 液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091711.D) mAU
40
30 20
！TF=？
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1
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4ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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8
9 min
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流动相： 甲醇：水=65：35
流速：
1 mL/min
温度：
35℃
检测波长： 230 nm
进样量： 20 μL
硅胶基质类型及发展史
Type A：原料来源：水玻璃；高金属含量， 高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附
Brand W, AQ Column 5μm, 4.6mm×150mm
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091702.D) mAU
40 30 20 10
3.008 4.084
TF=1.31
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091208.D) mAU
峰对称性《 基质表面特性，键合类型，流动相，温度 保留体积《 柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键
合类型；流动相，温度 灵敏度《 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 稳定性和重现性《 基质表面特性，键合类型；流动相，温
度
流动相 《 pH，缓冲盐种类，溶剂；
影响色谱柱性能的主要因素
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 • 窄径柱 ( 2.1mm) – 满足检测器和样品量限制 • 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高，抗污染，寿命
制备柱 (内径> 10 mm) – 用于纯化制备
柱填料对色谱柱性能的影响
灵敏度
ＬＯＤ：Limit of Detection ＬＯＱ：Limit of Quantification
－ 柱效 －峰形（拖尾因子）
重现性
分离度（Ｒ） －保留时间（Ｖ，Ｔ，Ｋ） －选择性（ α） －柱效 （Ｎ）
灵敏度
色谱柱类型、选择和方法开发
色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响
分离度《 - 选择性 〈 键合类型，基质表面特性；流动相、温度 - 柱效 〈 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相， 温度，上样量，流速
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3.944 5.934
Brand Z,C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091202.D) mAU
25
20
TF=1.69
15
10
Area: 176.686
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Brand U,C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
水中； 20min梯度，10 30%B；60°C，
1.5ml/min
由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大
柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I
硅胶纯度－金属含量
OH OH
OH
2.3-二羟基萘
HO
2.7-二羟基萘
2.899 2.450
3.471
Venusil MP C18 5μm, 4.6mm×150mm Brand H, C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检 测器（流通池）
分离度
R s( N)•(a1)•( k ) 4 a k1
• Rs - Resolution • N – Theoretical Plate Number •α– Selectivity • k – Retention Factor •拖尾
1.Separation of Compounds A and B
40 35 30 25 20 15 10
TF=1.42
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07090605.D) mAU
50 40 30 20 10
2.275 2.889
Area: 253.288
Area: 400.399
TF=1.39
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柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径
硅胶粒径和类型对柱效的影响
硅胶粒径和类型对压力的影响
d
柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II
目前市场主要可供选择的填料粒径
• 1.7μm，1.8μm，2.2μm － 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 • 2.7μm － 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) • 3.0μm，3.5μm － 普通快速分析 • 5.0μm － 常规分析
杂化及表面杂化 整体柱 壳层柱
样品分子直径小于平均孔 径，才能进入微粒内部
孔径至少是样品流体学直 径的4倍
300Ǻ孔径用于：超过50个 氨基酸的肽或25个残基的低 聚寡核苷酸
样品分子直径小于平均孔径， 才能进入微粒内部
柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II
条件： C8色谱柱，4.6×150mm， 3.5um，
A溶剂，0.1%TFA水溶液； B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈－
1、 色谱柱的构型 • 色谱柱内径 • 色谱柱长度
2、 固定相柱填料 • 粒径 • 比表面积 • 孔径 • 孔隙率 • 基质表面特性： - 表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 - 耐碱性 • 键合类型 - 官能团、是否封尾 - 键合相的保留行为、耐酸性
色谱柱的构型对色谱柱性能的影响
色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径 色谱柱尺寸 对色谱分离的影响：
颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高.
柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积
每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间
增加(梯度洗脱尤为注意) 根据需要选择合适的比表面积
柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I
多孔材料的95%以上表面 在孔内部
怎样选择色谱柱液相色谱柱的种类与方法开发文稿演示
（优选）怎样选择色谱柱液相 色谱柱的种类与方法开发
色谱基本概念回顾
色谱（chromatography）
色谱原理 色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）
；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相 色谱功能：分析（种类/定量），纯化 液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091711.D) mAU
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流动相： 甲醇：水=65：35
流速：
1 mL/min
温度：
35℃
检测波长： 230 nm
进样量： 20 μL
硅胶基质类型及发展史
Type A：原料来源：水玻璃；高金属含量， 高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附
Brand W, AQ Column 5μm, 4.6mm×150mm
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091702.D) mAU
40 30 20 10
3.008 4.084
TF=1.31
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091208.D) mAU
峰对称性《 基质表面特性，键合类型，流动相，温度 保留体积《 柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键
合类型；流动相，温度 灵敏度《 粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度 稳定性和重现性《 基质表面特性，键合类型；流动相，温
度
流动相 《 pH，缓冲盐种类，溶剂；
影响色谱柱性能的主要因素
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 • 窄径柱 ( 2.1mm) – 满足检测器和样品量限制 • 宽径柱 (3-7.8 mm) - 载样量高，抗污染，寿命
制备柱 (内径> 10 mm) – 用于纯化制备
柱填料对色谱柱性能的影响
灵敏度
ＬＯＤ：Limit of Detection ＬＯＱ：Limit of Quantification
－ 柱效 －峰形（拖尾因子）
重现性
分离度（Ｒ） －保留时间（Ｖ，Ｔ，Ｋ） －选择性（ α） －柱效 （Ｎ）
灵敏度
色谱柱类型、选择和方法开发
色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响
分离度《 - 选择性 〈 键合类型，基质表面特性；流动相、温度 - 柱效 〈 保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相， 温度，上样量，流速
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Brand Z,C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07091202.D) mAU
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TF=1.69
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Brand U,C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
水中； 20min梯度，10 30%B；60°C，
1.5ml/min
由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大
柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I
硅胶纯度－金属含量
OH OH
OH
2.3-二羟基萘
HO
2.7-二羟基萘
2.899 2.450
3.471
Venusil MP C18 5μm, 4.6mm×150mm Brand H, C18 Column 5μm, 4.6mm×150mm
合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检 测器（流通池）
分离度
R s( N)•(a1)•( k ) 4 a k1
• Rs - Resolution • N – Theoretical Plate Number •α– Selectivity • k – Retention Factor •拖尾
1.Separation of Compounds A and B
40 35 30 25 20 15 10
TF=1.42
VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF\07090605.D) mAU
50 40 30 20 10
2.275 2.889
Area: 253.288
Area: 400.399
TF=1.39
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柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径
硅胶粒径和类型对柱效的影响
硅胶粒径和类型对压力的影响
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柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II
目前市场主要可供选择的填料粒径
• 1.7μm，1.8μm，2.2μm － 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 • 2.7μm － 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) • 3.0μm，3.5μm － 普通快速分析 • 5.0μm － 常规分析