钙离子量测定

注射用重组人凝血因子Ⅷ-Fc融合蛋白
辅料含量钙离子检测SOP
1、实验原理：
钙与邻-甲酚酞络合铜混合，在pH11.0±1.0缓冲溶液中形成紫色络合物，在570nm波长出现最大峰，用8-羟基喹啉消除镁离子的干扰。

2、试剂与试液：
邻-甲酚酞络合铜溶液、钙标准溶液、8-羟基喹啉溶液、乙醇胺-硼酸盐缓冲液。

3、仪器与材料：
实验仪器：紫外可见分光光度计。

材料：
（1）储备乙醇胺-硼酸盐缓冲液：向盛有50ml水的500ml烧杯中加入18科硼酸并搅拌，加入50ml乙醇胺，搅拌，待硼酸溶解后，将
溶液移入容量瓶中，并用乙醇胺定容至500ml。

临用时用蒸馏水
做1：20倍稀释。

（2）邻-甲酚酞络合铜溶液：向25ml水中加入80mg邻-甲酚酞络合铜和0.5ml 1M的氢氧化钾溶液，搅拌至溶解后加入75ml的水和
0.5ml的冰醋酸。

（3）储备8-羟基喹啉溶液：在100ml 95%酒精中溶解5g 8-羟基喹啉，作储备用液。

（4）工作显色液：乙醇胺-硼酸盐缓冲液50μl+950μl纯化水（1：20倍稀释），然后抽取500μl,再加500μl邻-甲酚酞络合铜再加250μl8-
羟基喹啉溶液，定容至25ml。

（5）钙标准使用液：用西亚Ca标准溶液（浓度为1000μg/ml），稀释成0.025mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.25mmol/L
做标曲（分别加10μl、20μl、40μl、80μl、100μl标准品定容至10ml.)。

4、操作方法：
4.1样品预处理：将供试品溶解后，50倍稀释（10μl供试品溶液+490μl
纯化水）。

4.2工作曲线制备及样品测定：
（1）工作曲线制备：分别取系列浓度（mmol/L）钙标准使用液200μl 于试管中，向各管内加1ml工作显色液，混合后用紫外分光光度计于570nm 处读取吸光度，绘制工作曲线。

相关系数应不低于0.99。

（2）样品测定：将4.1中处理后的待测样品代替标准液，按上述方法测定，并将测定后的吸光度代入工作曲线的直线回归方程，求得钙离子的浓度(mmol/ L) ，得出的钙离子浓度乘以稀释倍数50即为供试品中的钙离子含量。

5、结构判定：
若供试品中钙离子含量在4.7~5.3 mmol/ L，则判定为符合规定；否则，判为不符合规定。