实验动物学第十三章遗传工程动物
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1980年，Gordon等把HSV-tk的基因显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了 两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。
1982年Palmiter等将大鼠的生长素基因和牛的生长素基因分别注射到小白鼠 的受精卵中，得到了体型巨大的“超级小鼠”。
1985年Smithies等首先在β球蛋白位点上进行基因打靶，获得基因敲除小鼠。 1987年英国Roslin研究所研制成功-抗胰蛋白酶转基因绵羊，乳汁中分泌-
表达的组织 各种组织 乳腺 乳腺 肝脏 心脏
12
用内切酶将基因 片段切下来备用
13
2.动物的准备 1）供受精卵雌鼠：提供受精卵用于显微注射 2）正常雄鼠：与供受精卵雌鼠交配产生受精卵 3）受体（假孕）雌鼠：显微注射后胚胎的移植受
体。为了使子宫内膜变化与胚胎着床同步，需 要与结扎雄鼠交配 4）结扎雄鼠：因输精管结扎，不会排精。与雌鼠 交配，产生受体（假孕）雌鼠，不会受孕，但 可使雌鼠黄体活化，维持妊娠状态。
14
转基因实验需用的各类小鼠
鼠 类 供受精卵鼠
鼠龄
4～6周
体重
＞15克
正常雄鼠 ＞8周 ＞22克
受体雌鼠 ＞8周 ＞25克
结扎雄鼠 ＞8周 ＞25克
作 用 受精卵供体 与供体雌鼠交配 注射卵移植受体 与受体雌鼠交配
更换频率
每次
饲 养 每笼3～5只
一般6～8个月 每笼1只
每次
1～3只与结扎雄鼠 合笼
遗传工程动物包括所有用遗传工程技术制备的动物， 但有时人们常把“转基因动物”泛指为“遗传工程动物”。 狭义的转基因动物一般仅指用显微注射法和逆转录病毒法 制备的，即“加入”一个外源基因的动物。
6
遗传工程动物的分类
转基因动物（Transgenic animals)： 加入一个外源基因
基因敲除动物(Gene knockout animals)： 使一个基因功能失活
基因敲入动物(Gene knockin animals)： 加入或替换一个基因
染色体工程动物(Chromosome engineered animals)： 使染色体片断缺失、易位、倒置、 重复
7
转基因和基因敲除
疾病相关或功能未知基因
“加法”
“减法”
功能获得
?
功能缺失
8
第二节 遗传工程动物技术的发展概况
抗胰蛋白酶含量高达30mg/L。 1995年Ramirez-Solis等首先制作成功染色体重排小鼠。 2000年McCreath等用体细胞基因打靶获得转基因绵羊， 乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高达650ug ml。
9
近年来基因敲除新技术获得重大突破
1994年Kim等发明锌指核酶（Zinc-finger nucleases，ZFN） 技术，2009年已经被成功用于好几个不同的物种，如小鼠、 斑马鱼、果蝇、大鼠等进行基因敲除。
5
遗传工程动物的定义 遗传工程动物（Genetically engineered Animals）
是指将外源基因或经改造的自身基因片段导入动物受精卵 或早期胚胎，使之稳定整合于宿主的染色体基因组内，并 能遗传给后代的一类动物。
遗传工程动物亦有称为基因修饰动物（Gene modified animals)。
• 纯合子： 一对等位基因彼此相同，叫纯合子（Homozygote)
• 杂合子： 一对等位基因彼此不同，叫杂合子（Heterozygote)
• 半合子： 一条染色体上增加了一个外源基因，叫半合子（Semizygote)
4
外源基因构件（construct）:将外源基因片段通 过分子生物学的方法组合起来，以达到设计的目 的。这种重组的DNA片段称为外源基因构件。 载体（vector）：带有宿主DNA序列的外源基因 构件称为载体。它起着将外源基因构件带到特定 位置的作用。
一般6～8个月 每笼1只
备注
产过仔的较好
结扎后两周用
15
3. 显微注射法制备转基因动物步骤
♂ ♀
结扎公鼠
成年雌鼠
假孕雌鼠
DNA构件
外源基因 鉴定方法：
PCR S显微注射法制备转基因动物 （一）原理
将带有完整序列的外源基因构件通过显微注射 注入到受精卵的雄性原核中，外源基因随机插入并 整合到染色体上的任意序列中。将显微注射后的受 精卵经体外培养，移植到假孕动物的输卵管内。子 代出生后用分子生物学方法鉴定，确认整合有外源 基因的动物即为转基因动物。
rRNA & tRNA
3. 调控序列
基因组（Genome）：储存有生物体内全部遗传信息的全套染色体，称 之为基因组。
外源基因（Foreign gene or Transgene）：外来的、非自身基因成 分。
3
• 基因型： 生物所具有的基因成分，叫基因型（Genotype)
• 表现型： 生物所显示的遗传性状，叫表现型（Phenotype)
第十三章 遗传工程动物
1
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
概述 转基因动物技术的发展概况 遗传工程动物的制备方法 遗传工程动物的建系和保种 遗传工程动物的应用
2
第一节 概 述
概念
基因（Gene）：位于染色体上具有遗传效应的DNA片断。
三类：
1. 编码蛋白质：DNA
mRNA
Protein
2. 编码RNA：DNA
11
（二）步骤 1.制备外源目的基因构件 •外源基因构件必须包括：启动子、外源基因编码区、Poly A（终止）信号 •启动子的组织特异性决定了外源基因表达的时空特异性：
启动子 CMV WAP β-Lactoglobulin Albumin enhancer α myosin heavy chain
2011年8月，《NATURE BIOTECHNOLOGY》同时发表用TALEN （trascription activator-like effector nucleases）技 术进行大鼠和斑马鱼基因敲除的论文。
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表 了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方 法,利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的 具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。其优点： 多位点打靶，实验更简便，无物种限制。
1982年Palmiter等将大鼠的生长素基因和牛的生长素基因分别注射到小白鼠 的受精卵中，得到了体型巨大的“超级小鼠”。
1985年Smithies等首先在β球蛋白位点上进行基因打靶，获得基因敲除小鼠。 1987年英国Roslin研究所研制成功-抗胰蛋白酶转基因绵羊，乳汁中分泌-
表达的组织 各种组织 乳腺 乳腺 肝脏 心脏
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用内切酶将基因 片段切下来备用
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2.动物的准备 1）供受精卵雌鼠：提供受精卵用于显微注射 2）正常雄鼠：与供受精卵雌鼠交配产生受精卵 3）受体（假孕）雌鼠：显微注射后胚胎的移植受
体。为了使子宫内膜变化与胚胎着床同步，需 要与结扎雄鼠交配 4）结扎雄鼠：因输精管结扎，不会排精。与雌鼠 交配，产生受体（假孕）雌鼠，不会受孕，但 可使雌鼠黄体活化，维持妊娠状态。
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转基因实验需用的各类小鼠
鼠 类 供受精卵鼠
鼠龄
4～6周
体重
＞15克
正常雄鼠 ＞8周 ＞22克
受体雌鼠 ＞8周 ＞25克
结扎雄鼠 ＞8周 ＞25克
作 用 受精卵供体 与供体雌鼠交配 注射卵移植受体 与受体雌鼠交配
更换频率
每次
饲 养 每笼3～5只
一般6～8个月 每笼1只
每次
1～3只与结扎雄鼠 合笼
遗传工程动物包括所有用遗传工程技术制备的动物， 但有时人们常把“转基因动物”泛指为“遗传工程动物”。 狭义的转基因动物一般仅指用显微注射法和逆转录病毒法 制备的，即“加入”一个外源基因的动物。
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遗传工程动物的分类
转基因动物（Transgenic animals)： 加入一个外源基因
基因敲除动物(Gene knockout animals)： 使一个基因功能失活
基因敲入动物(Gene knockin animals)： 加入或替换一个基因
染色体工程动物(Chromosome engineered animals)： 使染色体片断缺失、易位、倒置、 重复
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转基因和基因敲除
疾病相关或功能未知基因
“加法”
“减法”
功能获得
?
功能缺失
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第二节 遗传工程动物技术的发展概况
抗胰蛋白酶含量高达30mg/L。 1995年Ramirez-Solis等首先制作成功染色体重排小鼠。 2000年McCreath等用体细胞基因打靶获得转基因绵羊， 乳汁中分泌-抗胰蛋白酶含量高达650ug ml。
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近年来基因敲除新技术获得重大突破
1994年Kim等发明锌指核酶（Zinc-finger nucleases，ZFN） 技术，2009年已经被成功用于好几个不同的物种，如小鼠、 斑马鱼、果蝇、大鼠等进行基因敲除。
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遗传工程动物的定义 遗传工程动物（Genetically engineered Animals）
是指将外源基因或经改造的自身基因片段导入动物受精卵 或早期胚胎，使之稳定整合于宿主的染色体基因组内，并 能遗传给后代的一类动物。
遗传工程动物亦有称为基因修饰动物（Gene modified animals)。
• 纯合子： 一对等位基因彼此相同，叫纯合子（Homozygote)
• 杂合子： 一对等位基因彼此不同，叫杂合子（Heterozygote)
• 半合子： 一条染色体上增加了一个外源基因，叫半合子（Semizygote)
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外源基因构件（construct）:将外源基因片段通 过分子生物学的方法组合起来，以达到设计的目 的。这种重组的DNA片段称为外源基因构件。 载体（vector）：带有宿主DNA序列的外源基因 构件称为载体。它起着将外源基因构件带到特定 位置的作用。
一般6～8个月 每笼1只
备注
产过仔的较好
结扎后两周用
15
3. 显微注射法制备转基因动物步骤
♂ ♀
结扎公鼠
成年雌鼠
假孕雌鼠
DNA构件
外源基因 鉴定方法：
PCR S显微注射法制备转基因动物 （一）原理
将带有完整序列的外源基因构件通过显微注射 注入到受精卵的雄性原核中，外源基因随机插入并 整合到染色体上的任意序列中。将显微注射后的受 精卵经体外培养，移植到假孕动物的输卵管内。子 代出生后用分子生物学方法鉴定，确认整合有外源 基因的动物即为转基因动物。
rRNA & tRNA
3. 调控序列
基因组（Genome）：储存有生物体内全部遗传信息的全套染色体，称 之为基因组。
外源基因（Foreign gene or Transgene）：外来的、非自身基因成 分。
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• 基因型： 生物所具有的基因成分，叫基因型（Genotype)
• 表现型： 生物所显示的遗传性状，叫表现型（Phenotype)
第十三章 遗传工程动物
1
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
概述 转基因动物技术的发展概况 遗传工程动物的制备方法 遗传工程动物的建系和保种 遗传工程动物的应用
2
第一节 概 述
概念
基因（Gene）：位于染色体上具有遗传效应的DNA片断。
三类：
1. 编码蛋白质：DNA
mRNA
Protein
2. 编码RNA：DNA
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（二）步骤 1.制备外源目的基因构件 •外源基因构件必须包括：启动子、外源基因编码区、Poly A（终止）信号 •启动子的组织特异性决定了外源基因表达的时空特异性：
启动子 CMV WAP β-Lactoglobulin Albumin enhancer α myosin heavy chain
2011年8月，《NATURE BIOTECHNOLOGY》同时发表用TALEN （trascription activator-like effector nucleases）技 术进行大鼠和斑马鱼基因敲除的论文。
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表 了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方 法,利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的 具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。其优点： 多位点打靶，实验更简便，无物种限制。