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鼠疫实验室检测技术
一、鼠疫菌菌体形态检查
典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长1~2µm，宽 0.5~0.7µm,中段膨大，两端钝圆，且两极浓染 的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。 革兰氏染色阴性。
染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压 印片，可见到两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫 菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌， 对于鉴别杂菌污染材料极有价值。
鼠疫实验室检测技术
二、鼠疫菌的培养特性
鼠疫菌是典型的异养菌。 鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。 鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为28℃，最适
pH为6.9-7.1，发育初期的最适氧化还原电位（Eh）约为 100~150mV，接种后至少20h以上才能形成肉眼可见的菌落， 一般24~48h形成肉眼可见的小菌落。 强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。37℃缺钙 条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量Yops,表现很强的表达 和分泌毒力蛋白V抗原（LcrV）。此现象称为低钙反应，受 70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制。 典型鼠疫菌培养18-20h光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养24h 以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落 圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗 粒，周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的 花边。
鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红 色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明 显）、姬姆萨染色（菌体染成色，荚膜染成色）
鼠疫实验室检测技术
鼠疫菌染色检查(脏器压印片)
革兰氏染色
美兰染色
鼠疫实验室检测技术
鼠疫菌染色
鼠疫菌涂片的革兰氏染色
鼠疫实验室检测技术
鼠疫菌染色检查
Wayson stain(魏申氏染 荚膜染色—墨汁负染色 色)呈现的两极浓染特 征
RIHA微量法结果：
鼠疫实验室检测技术
酶联免疫吸附试验(ELIபைடு நூலகம்A)
测抗体.
测抗原
➢
双抗原夹心法：F1抗原包被反应板，➢ 加入待测标本28℃反应1.5h洗板， 加入HRP-F1抗原28℃反应1h洗板， 加入底物OPD蔽光反应30min后加 终止液(2mol/L硫酸)。
双单抗夹心法： F1-McAb包被反应 板，加入标本28℃反应1.5h洗板，加 入HRP-F1McAb 28℃反应1h洗板， 加入底物OPD蔽光反应30min后加终 止液。
鼠疫实验室检测技术
间接红血球凝集试验(IHA)
鼠疫菌特异性F1抗原致敏经单宁酸鞣化 处理的醛化绵羊红血球，制备成F1抗原 致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗体。试 验方法和结果判定均为常规操作。
IHA微量法结果：
鼠疫实验室检测技术
反向血球凝集试验(RIHA)
用F1抗体致敏血球，检查鼠疫特异性F1 抗原。试验方法和结果判定与IHA相同。
➢ 用肉眼观察结果并用酶标仪检测每 孔的吸光度值(A)
HRP标记的羊抗小鼠IgG 37℃反应1h 洗板,加底物OPD蔽光反应30min显色， 加终止液。
➢ 肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的 吸光度值(A)
鼠疫实验室检测技术
胶体金免疫层析法(GICA)
检测鼠疫菌特异性抗原、抗体的金标技术以 GICA广泛用于实践。基本原理均为夹心法。
➢ 鼠疫噬菌体试验可快速诊断鼠疫菌。对被检材料作 细菌分离培养的同时作噬菌体裂解试验，20h左右 即可获得结果。
➢ 分离到鼠疫噬菌体，可以间接判定检材中存在鼠疫 菌。
鼠疫实验室检测技术
鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验
典型鼠疫菌菌落形态 噬菌带
鼠疫实验室检测技术
鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验
鼠疫菌培养特征
鼠疫噬菌体试验
鼠疫实验室检测技术
三、鼠疫F1抗原、抗体检测
鼠疫F1抗原检测
鼠疫F1抗体检测
1.反向血球凝集试验(RIHA) 1.间接血球凝集试验(IHA)
2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA)
3.胶体金免疫层析法(GICA) 3.胶体金免疫层析法(GICA)
4.免疫荧光技术(IFT)
双抗体夹心法测抗原：固定于NC膜上的单抗 (F1McAb)+标本中待测抗原(F1Ag)+金标记的另 一株单抗(金标-F1McAb)显色。
双抗原夹心法测抗体：固定于NC膜上的鼠疫F1 抗原(F1Ag)+标本中待测抗体(F1Ab)+金标记的 F1抗原(金标-F1Ag)显色。
夹心法测抗体：固定于膜上的鼠疫F1抗原＋标 本中的相应抗体＋金标记的SPA显色。
鼠疫实验室检测技术
鼠疫噬菌体试验
➢ 在培基上密集平行划线培养鼠疫菌，鼠疫噬菌体滴 于上端划线中部，直立平板，使噬菌体液垂直划线 自然流下，置20℃培养24h,有明显的噬菌带。
➢ 在18~22℃鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假 结核菌，具有较强的专一性(噬菌作用具有种的特异 性)，是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。
鼠疫实验室检测技术
GICA双抗体夹心法—测抗原
标本
G区：金标特异性抗体 (鼠型F1McAb)
T区：特异性单 克隆抗体 (F1McAb)
鼠疫实验室检测技术
吸水纸
C区：羊抗 小鼠Ig
免疫荧光技术(IFT)
标记物-荧光素(如异硫氰荧光素 Yersinia pestis 免疫荧光染色 FITC)
荧光素标记抗体检测相应抗原-直 接法：如FITC-FIMcAb为异硫氰 酸荧光黄标记鼠疫F1单克隆抗体。
➢
间接法： 已知F1抗原包被反应板， ➢ 加标本37℃反应1h洗板，加入酶标 二抗37℃反应1h洗板，加入底物 (如OPD或TMB)蔽光反应30min显 色后加终止液。
双抗体夹心法(改良法-美国CDC鼠疫 诊断技术实验室操作手册)：鼠疫免疫 血清特异性抗体( F1Ab)包被反应板， 加标本37℃反应1h洗板，加小鼠 F1McAb 液37℃静置1h洗板，加
鼠疫实验室检测技术
鼠疫实验室检测技术
鼠疫实验室检测
针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性 的检测：鼠疫菌的染色检查；鼠疫菌的培养 及鼠疫噬菌体试验；鼠疫菌的生化检查、营 养需求、毒素检测、毒力测定等。
针对病原体特异性抗原结构的检测：鼠疫F1 抗原抗体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。
针对病原体遗传基因的检测：鼠疫菌的质粒 检测；鼠疫菌特异性核酸片断的检测；鼠疫 菌全基因组测定；插入序列的检测。
一、鼠疫菌菌体形态检查
典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长1~2µm，宽 0.5~0.7µm,中段膨大，两端钝圆，且两极浓染 的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。 革兰氏染色阴性。
染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压 印片，可见到两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫 菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌， 对于鉴别杂菌污染材料极有价值。
鼠疫实验室检测技术
二、鼠疫菌的培养特性
鼠疫菌是典型的异养菌。 鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。 鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为28℃，最适
pH为6.9-7.1，发育初期的最适氧化还原电位（Eh）约为 100~150mV，接种后至少20h以上才能形成肉眼可见的菌落， 一般24~48h形成肉眼可见的小菌落。 强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。37℃缺钙 条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量Yops,表现很强的表达 和分泌毒力蛋白V抗原（LcrV）。此现象称为低钙反应，受 70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制。 典型鼠疫菌培养18-20h光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养24h 以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落 圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗 粒，周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的 花边。
鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红 色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明 显）、姬姆萨染色（菌体染成色，荚膜染成色）
鼠疫实验室检测技术
鼠疫菌染色检查(脏器压印片)
革兰氏染色
美兰染色
鼠疫实验室检测技术
鼠疫菌染色
鼠疫菌涂片的革兰氏染色
鼠疫实验室检测技术
鼠疫菌染色检查
Wayson stain(魏申氏染 荚膜染色—墨汁负染色 色)呈现的两极浓染特 征
RIHA微量法结果：
鼠疫实验室检测技术
酶联免疫吸附试验(ELIபைடு நூலகம்A)
测抗体.
测抗原
➢
双抗原夹心法：F1抗原包被反应板，➢ 加入待测标本28℃反应1.5h洗板， 加入HRP-F1抗原28℃反应1h洗板， 加入底物OPD蔽光反应30min后加 终止液(2mol/L硫酸)。
双单抗夹心法： F1-McAb包被反应 板，加入标本28℃反应1.5h洗板，加 入HRP-F1McAb 28℃反应1h洗板， 加入底物OPD蔽光反应30min后加终 止液。
鼠疫实验室检测技术
间接红血球凝集试验(IHA)
鼠疫菌特异性F1抗原致敏经单宁酸鞣化 处理的醛化绵羊红血球，制备成F1抗原 致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗体。试 验方法和结果判定均为常规操作。
IHA微量法结果：
鼠疫实验室检测技术
反向血球凝集试验(RIHA)
用F1抗体致敏血球，检查鼠疫特异性F1 抗原。试验方法和结果判定与IHA相同。
➢ 用肉眼观察结果并用酶标仪检测每 孔的吸光度值(A)
HRP标记的羊抗小鼠IgG 37℃反应1h 洗板,加底物OPD蔽光反应30min显色， 加终止液。
➢ 肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的 吸光度值(A)
鼠疫实验室检测技术
胶体金免疫层析法(GICA)
检测鼠疫菌特异性抗原、抗体的金标技术以 GICA广泛用于实践。基本原理均为夹心法。
➢ 鼠疫噬菌体试验可快速诊断鼠疫菌。对被检材料作 细菌分离培养的同时作噬菌体裂解试验，20h左右 即可获得结果。
➢ 分离到鼠疫噬菌体，可以间接判定检材中存在鼠疫 菌。
鼠疫实验室检测技术
鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验
典型鼠疫菌菌落形态 噬菌带
鼠疫实验室检测技术
鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验
鼠疫菌培养特征
鼠疫噬菌体试验
鼠疫实验室检测技术
三、鼠疫F1抗原、抗体检测
鼠疫F1抗原检测
鼠疫F1抗体检测
1.反向血球凝集试验(RIHA) 1.间接血球凝集试验(IHA)
2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA)
3.胶体金免疫层析法(GICA) 3.胶体金免疫层析法(GICA)
4.免疫荧光技术(IFT)
双抗体夹心法测抗原：固定于NC膜上的单抗 (F1McAb)+标本中待测抗原(F1Ag)+金标记的另 一株单抗(金标-F1McAb)显色。
双抗原夹心法测抗体：固定于NC膜上的鼠疫F1 抗原(F1Ag)+标本中待测抗体(F1Ab)+金标记的 F1抗原(金标-F1Ag)显色。
夹心法测抗体：固定于膜上的鼠疫F1抗原＋标 本中的相应抗体＋金标记的SPA显色。
鼠疫实验室检测技术
鼠疫噬菌体试验
➢ 在培基上密集平行划线培养鼠疫菌，鼠疫噬菌体滴 于上端划线中部，直立平板，使噬菌体液垂直划线 自然流下，置20℃培养24h,有明显的噬菌带。
➢ 在18~22℃鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假 结核菌，具有较强的专一性(噬菌作用具有种的特异 性)，是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。
鼠疫实验室检测技术
GICA双抗体夹心法—测抗原
标本
G区：金标特异性抗体 (鼠型F1McAb)
T区：特异性单 克隆抗体 (F1McAb)
鼠疫实验室检测技术
吸水纸
C区：羊抗 小鼠Ig
免疫荧光技术(IFT)
标记物-荧光素(如异硫氰荧光素 Yersinia pestis 免疫荧光染色 FITC)
荧光素标记抗体检测相应抗原-直 接法：如FITC-FIMcAb为异硫氰 酸荧光黄标记鼠疫F1单克隆抗体。
➢
间接法： 已知F1抗原包被反应板， ➢ 加标本37℃反应1h洗板，加入酶标 二抗37℃反应1h洗板，加入底物 (如OPD或TMB)蔽光反应30min显 色后加终止液。
双抗体夹心法(改良法-美国CDC鼠疫 诊断技术实验室操作手册)：鼠疫免疫 血清特异性抗体( F1Ab)包被反应板， 加标本37℃反应1h洗板，加小鼠 F1McAb 液37℃静置1h洗板，加
鼠疫实验室检测技术
鼠疫实验室检测技术
鼠疫实验室检测
针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性 的检测：鼠疫菌的染色检查；鼠疫菌的培养 及鼠疫噬菌体试验；鼠疫菌的生化检查、营 养需求、毒素检测、毒力测定等。
针对病原体特异性抗原结构的检测：鼠疫F1 抗原抗体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。
针对病原体遗传基因的检测：鼠疫菌的质粒 检测；鼠疫菌特异性核酸片断的检测；鼠疫 菌全基因组测定；插入序列的检测。