主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第九章 酶免疫技术

第九章酶免疫技术
第一节酶免疫技术的特点
酶免疫技术是将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。

它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，此结合物既保留了抗体或抗原的免疫学活性，同时又保留了酶对底物的催化活性。

在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。

它通过利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高了抗原抗体反应的敏感性。

它具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好、酶标记试剂能够较长时间保持稳定、操作简便、对环境没有污染等优点，而且容易与其他技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。

一、酶和酶作用底物
（一）酶的要求
1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。

2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。

3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。

4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。

5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。

（二）常用的酶
1.辣根过氧化物酶（HRP）
2.碱性磷酸酶（AP）
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）
（三）常用的底物
1.辣根过氧化物酶的底物
（1）邻苯二胺（OPD）
0PD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液中。

（2）四甲基联苯胺（TMB） ELISA中应用最广泛的底物。

（3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）也是HRP常用的底物。

2.碱性磷酸酶（AP）的底物
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）
常用对-硝基苯磷酸脂（p-NPP），p-NPP经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。

常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。

二、酶标记抗体或抗原
酶标记抗体或抗原是指通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。

（一）酶标记抗体或抗原的制备
用于制备酶标志物的抗原要求纯度高，抗原性完整（半抗原应先与大分子载体蛋白交联）。

抗体则不仅需要特异性好、效价高、亲和力强以及比活性较高，而且还需要能批量生产和易予分离纯化。

目前常根据具体方法要求选用单克隆抗体、多克隆抗体经纯化的Ig组分、Ig的Fab'和F（ab’）2片段等。

1.戊二醛交联法
2.改良过碘酸钠法
目前用于HRP标记抗体或抗原的最常用方法
（二）酶标志物的纯化
标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原。

常用的纯化方法有葡聚糖凝胶C-200／G-150过柱层析纯化和50%饱和硫酸铵沉淀提纯。

（三）酶标志物的鉴定
质量鉴定包括酶活性和抗体（抗原）的免疫活性鉴定。

常用免疫电泳或双向扩散法，出现沉淀线表示酶标志物中的抗体（抗原）具有免疫活性。

沉淀线经生理盐水反复漂洗后，滴加酶的底物溶液，若在沉淀线上能显色，则表示酶标志物中的酶活性仍保留。

三、固相载体
（一）固相载体的要求
结合抗体或抗原的容量大；可将抗体或抗原牢固地固定在其表面，经长期保存和多次洗涤也不易脱落；不影响所固定的抗体或抗原的免疫反应性，而且为使反应充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液，固相方法简便易行，快速经济。

（二）固相载体的种类和选择
1.塑料制品
2.微粒
3.膜载体
（三）包被与封闭
1.包被
将抗原或抗体结合在固相载体上的过程称为包被。

2.封闭
需用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除非特异性显色，此过程称为封闭。

第二节酶免疫技术的分类
酶免疫技术按实际应用目的可分为两大类：
酶免疫测定（EIA）：液体标本中抗原或抗体的定性和定量。

酶免疫组织化学技术：组织切片或其他标本中抗原的定位。

根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标志物分离，EIA一般可分为均相和异相两种类型。

EIA反应原理简示如下（标记抗体过量）：
Ag十Ab—E→AgAb—E+Ab—E
Ag为待检测抗原，AgAb-E为被结合酶标抗体，Ab-E先游离酶标抗体。

异相EIA为抗原抗体反应后；需
先将AgAb-E与Ab-E分离，然后再测定AgAb-E或AbE催化底物显色的活性，最后推算样品中Ag的含量。

EIA可分为液相EIA和固相EIA：
前者反应原理同放射免疫分析，试剂抗原（抗体）和待测抗体（抗原）均为液体，免疫反应在液体中进行，最后需用分离剂将游离与结合标志物分离后测定。

固相EIA则是先需制备一种固相的试剂抗原（抗体），再与样品待测抗体（抗原）以及酶标抗原（抗体）反应，经洗涤去除未结合的游离标志物后，即可对结合于固相载体的抗原抗体复合物进行测定。

EIA均相法反应原理如下：
均相法则是利用Ab-E结合Ag形成AgAb-E复合物后，标记酶（E）的活性会发生改变，可以在不将AgAb-E 与Ab-E分离的情况下，通过直接测定系统中总的标记酶活性改变，即可确定AgAb-E的形成量，并进而推算出样品中待检Ag的浓度。

均相酶免疫测定：
均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定。

均相法的优点是适合于自动化测定。

最早取得临床实际应用的均相酶免疫试验是酶放大免疫测定技术（EMIT）。

前最为成功的是克隆酶供体免疫测定（CEDIA）。

（一）酶放大免疫测定技术（EMIT）
基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。

当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制。

反应后酶活力大小与标本中的半抗原量呈一定的比例，从酶活力的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。

（二）克隆酶供体免疫分析（CDEIA）
DNA重组技术可分别合成某种功能酶（如β-D半乳糖苷酶）分子的两个片段，大片段称为酶受体（EA），小分子称作酶供体（ED），两者单独均无酶活性，一定条件下结合形成四聚体方具酶活性。

克隆酶供体免疫测定（CDEIA）的反应模式为竞争法。

标本中的抗原和酶供体（ED）标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。

ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与酶受体（EA）结合，而游离的ED标记的抗原上的ED可和EA 结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活性，酶活力的大小与标本中抗原含量成正比。

二、异相酶免疫测定
异相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类标记免疫测定技术。

依据测定方法是否采用固相材料以吸附抗原或抗体，又分为液相和固相酶免疫测定两类。

（一）液相酶免疫测定
主要用于检测样品中极微量的短肽激素和某些药物等小分子半抗原，近年来的发展使其灵敏度可达ng 至pg水平，与放射免疫测定相近。

（二）固相酶免疫测定
如常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）。

第三节酶联免疫吸附试验
一、基本原理
1.把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

2.将抗原或抗体与某种酶连接成酶标记抗原或抗体，它既保留了免疫活性，又保留了酶的活性。

3.测定时将受检样品（含待测抗原或抗体）和酶标记抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物。

4.用洗涤的方法将固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

5.加入底物后，底物被固相载体上的酶催化变成有色产物，通过定性或定量检测有色产物量即可确定样品中待测物质含量。

特点：由于酶催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的灵敏度。

二、方法类型及反应原理
三个必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶反应的底物。

抗原测定：蛋白大分子抗原用得最多的是双抗体夹心法。

只有单个抗原决定簇的小分子，则使用竞争抑制法。

抗体测定：通常使用间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法等。

（一）检测抗原的方法
属于非竞争结合测定，是检测抗原最常用的方法，适用于检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。

1.双抗体夹心法
双抗体夹心：固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物。

双抗体夹心法只适用于二价或二价以上的较大分子抗原的测定，不能用于小分子半抗原的检测。

临床上常用于乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等的检测。

2.双位点一步法
针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的两种单克隆抗体，即包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗。

测定时将含待测抗原标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经过一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。

当待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应（hook effect），显色降低，严重时可出现假阴性结果。

3.竞争法
主要用于测定小分子抗原。

原理为先用抗小分子的特异性抗体包被固相，然后同时加入待测样本和酶标记的小分子，待测样本中的小分子与酶标小分子竞争与固相上的抗小分子的特异性抗体结合，温育一定时间后洗涤，加入酶底物显色。

竞争法的特点：
酶标记抗原与样品中的非标记抗原具有相同的与固相抗体结合的能力。

反应体系中，固相抗体和酶标抗原是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量和。

免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原的量（酶活性）与样品中非标记抗原的浓度成反比。

（二）检测抗体的方法
1.间接法
将抗原包被在固相载体上，加入待测样本，使样本中待测抗体与固相载体上的抗原结合；加入酶标二抗，在固相上即形成固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。

检测抗体最常用的方法，属非竞争性结合试验。

间接法测抗体在目前应用最多的是丙型肝炎病毒抗体、人免疫缺陷病毒抗体和梅毒螺旋体抗体等的检测。

2.双抗原夹心法
临床上乙型肝炎表面抗体的测定常用此法。

3.竞争法
乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）的检测。

4.捕获法又称反向间接法。

主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定，目前最常用的是病原体急性感染诊断中的IgM型抗体。

如：甲型肝炎HAV-IgM抗体和乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体的检测。

第四节酶免疫测定的应用
均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测
非均相免疫测定中的ELISA广泛用于传染病的诊断，如肝炎病毒（甲肝抗体、“乙肝两对半”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒\结核分枝杆菌、幽门螺杆菌等。

也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。