RNA的选择性剪切

选择性剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机 制。 选择性剪接可以从一个基因产生多种蛋白，从而使蛋白质组 中蛋白质的数量超过基因组中基因的数量。其中，从影响基因的 数量和生物种类范围来看，选择性剪接是扩大蛋白质多样性的最 重要的机制
RNA的选择性剪切

二 单个基因选择性剪接的方式 1. 内含子的保留； 2. 可变外显子的保留或切除； 3. 3’和5’剪接位点的转移（shift）导致 外显子的增长或缩短。
NRDR的选择性剪切


已有不同组织的多种酶被认为参与这两步代谢过程。辅 酶 II 依 赖 性 视 黄 醇 脱 氢 酶 ( NADP-dependent retinol dehydrogenase/ reductase，NRDR)是由黄东阳教授 在兔肝细胞中纯化的一种新酶， NRDR普遍存在于哺乳 动物肝中，显示出较强的 Retinol 氧化与 Retinal 还原活 性。 兔、小鼠、人与牛肝脏NRDR cDNA全长已相继被克隆 （ GenBank 登 录 号 为 AB045133，AB045132， AB045131，AF487454），这些NRDR的C-末端都有过 氧化物酶体定位信号 -SRL，属于短链脱氢酶 / 还原酶家 族（ SDR）。预测这些 cDNA 编码区序列（ ORF），发 现它们均有两个 ORF，分别编码 278 与 260 个氨基酸， 后者符合Kozak序列。
NRDR的选择性剪切亚型
来源于PCR产物、cDNA 克隆、限制性酶切片断 的目的基因可以与供体 载体通过BP反应形成入 门克隆（entry clone）,目 的基因可以在入门克隆 与多种载体间通过LR反 应进行转换，形成表达 克隆。
NRDR的选择性剪切亚型
NRDR的选择性剪切亚型
三 选择性剪切亚型的细胞内定位 将 新 的 选 择 性 剪 切 亚 型 基 因 与 水 母 绿 色 荧 光 蛋白 （ GFP）基因融合，在哺乳动物细胞中表达，并用相 应的抗体及荧光标记二抗进一步确认其在细胞内的位 置。 四 新的选择性剪切亚型的体外重组表达 原核表达，真核表达 蛋白经分离、纯化后，测定其功能
NRDR的选择性剪切亚型



二 选择性剪切亚型全长cDNA的克隆 Invitrogen 3`RACE试剂盒 cDNA 合成引物:5`-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTT TTTTTTT TTTTTTT-3` First PCR sense:5`-tccaccgacgggatcggctt –3` AUAP: 5`-GGTGTGGGACAAGAGGCG-3` Nested PCR sense: 5`-tggtggccacgactctggacat-3` AUAP: 5`-GGTGTGGGACAAGAGGCG-3` Invitrogen 5`RACE试剂盒 cDNA 合成引物：5`-GCAGGAATCCCGAGT-3` First PCR AAP: 5`-GGCCACGCGTCGACTAGTAC GGGIIGGGIIGGGIIG-3` antisense: 5`-tcttatccgcagggtttcttt-3` Nested PCR AUAP:5`-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3` antisense: 5`-catccagagaggagatggactg-3`
RNA的选择性剪切
5’Exon GT GT Intron pre-mRNA Exon AG Intron GT AG Exon 3’
5’
Exon GT
Intron GT AG
Exon
Intron GT AG
Exon
3’
5’Exon
GT
Intron
AG GT AG
Exon
3’
5’
Exon GT
GT
Intron AG
NRDR的选择性剪切

人NRDR基因位于14号染色体长臂 (14q11.2, LOCUS NT_025892)，被命名 为DHRS4，由3个外显子簇（clusters）， 共97634碱基组成。Cluster 1 是人与哺乳 动物共有的保守序列，含有构成NRDR的 8个外显子，Cluster 2含有8个，Cluster 3 含有7个相对应的外显子。
Exon
3’
GT
AG
RNA的选择性剪切
三、选择生剪接的功能和生物学意义 1. 选择性剪接是在RNA水平调控基因表达的 机制之一。 2. 选择性剪接使生物表型具有多样性与复杂 性。
NRDR的选择性剪切


全反式维甲酸 (aRA) 通过与其在核内受体结合调节 基因的转录来发挥其重要的生理功能，包括正常胚 胎的发育，形态、神经系统的形成，成体动物的生 长，发育，繁殖等， 并通过调节组织及细胞的分化 来促使一些恶性肿瘤向良性转变。临床上我国科学 家率先将 aRA 用于急性早幼粒细胞白血病的治疗并 取得了良好的疗效。aRA在体内是由维生素A也称视 黄醇 (Retinol) 经两步代谢而成，中间代谢产物为视 黄醛(Retinal)， 即 Retinol ↔ Retinal → aRA
五 制备抗体，检测肿瘤组织中新亚型的蛋白表达
NRDR的选择性剪切亚型
Hela, BELT, EC9706细胞 株中发现新 的剪切亚型
NRDR的选择性剪切亚型
NRDR的选择性剪切亚型
NRDR的选择性剪切亚型
NRDR的选择性剪切亚型
预测新剪切亚型蛋白仍保留了部分SDR结构功能域，在20-27位氨基酸(TASTDGIG) 保留了辅酶结合模序（TAXXXGXG）,在130-134位氨基酸（YNVSK）保留了底物 结合区域模序（YXXSK），C-末端的过氧化物体定位信号(SRL)仍保留。
RNA的剪切修饰
Genome Transcriptome Proteome
DNA
RNA
Protein
RNA的剪切修饰
Genome:
5’Intergenic Gene Intergenic 3’
Transcription of pre-mRNA
5’Exon GT Donor Site Intron AG Acceptor Site Exon Intron GT AG Exon 3’
因为把内含子定义成从双核苷酸GT开始到双核苷酸AG结束，所以接点 经常被描述为遵守GT-AG法则，RNA中实际的序列为GU-AG法则。 GT-AG法则可以描述许多真核生物核基因中的剪接点。并不适用于线粒 体中的内含子，也不适用于酵母的tRNA基因
RNA的剪切修饰
第一阶段，在内含子 5 ′ 端剪接点形成一个切口，左边 的外显子以直线形式存在，右 边的内含子一外显子则开成索 套（这里内含子5′端和内含子 内一个碱基形成5′-2′键，这 个目标碱基为腺苷，被称为分 枝点）。 第二阶段，3′端剪接点的 剪切从索套形式中释放了内含 子，同时，右边的外显子和左 边的外显子连接起来。 第三阶段，索套随即脱离 分枝点，形成一个线性的删除 内含子，然后很快被降解。
人DHRS4基因结构、NRDR及其选择性剪切亚型的构造特点
NRDR的选择性剪切亚型
最近，在人宫颈癌细胞、肝癌细胞及食 管癌细胞中均发现新的NRDR剪切亚型 。 近年来，选择性剪切对于蛋白质多样性 及其与肿瘤的相关性引发人们关注。作 为参与合成、调节aRA的NRDR，出现 不同形式的剪切亚型，是否与肿瘤的发 生有相关性，值得深入研究。

NRDR的选择性剪切亚型

一 NRDR选择性剪切亚型的克隆
1.提取细胞总RNA: Trizol 法提取Hela, BELT, EC7-9706总RNA 2.逆转录为cDNA 3.PCR扩增： NRDR sense:5`-tccaccgacgggatcggctt-3` NRDR antisense:5`-atgccagcacaatcctctggct-3` NRDR iso sense:5`-atggccagctccgggatga-3` NRDRiso antisense:5`-tcagaggcgggacggggtt-3` 4.胶回收：PCR产物纯化 5.连接至质粒载体： pGEM-T easy 载体 6.转化至感受态大肠杆菌（JM109） 7.重组子筛选（蓝白筛选） 8.细菌扩大培养 9.提质粒 10.测序
通过对mRNA序列与结构基因核苷酸序列的比较，我们可以确定外显子 与内含子的接合点。发现，在一个内含子的两端并不存在广泛的相似性或 互补性。然而，接点还是具有很好的保守性，尽管只是短短的一致序列。
数字指示了特定的碱基在每个一致性位点存在的百分比。结果只在内 含子接点上有高一致性序列发现。这样，基因内含子序列就可以定义为： GT……AG
RNA的选择性剪切
以NRDR 的选择性剪切为例
汕头大学医学院
概论
知识背景 RNA的剪切修饰 RNA的选择性剪切 NRDR

知识背景（1）

生物的复杂性与其基因组基因数量似 乎存在明显差异 物种间，脊椎动物的相对应的DNA序 列有着惊人的相似。

百度文库
知识背景（2）

选择性剪切（alternative splicing）是物种进化重 要方式之一。 Neuropsin是一种主要在大脑海马区表达的丝 氨酸蛋白酶。该基因同学习和记忆的功能调节以 及大脑的发育相关。研究发现，小鼠仅表达 TypeI蛋白酶,检测的猕猴、滇金丝猴和长臂猿的 大脑中也只表达Type-I。在人的胚胎中，TypeI和 TypeII两种剪切方式都有表达，且丰度相似。在 成人脑中，TypeII蛋白酶成为优势表达的蛋白酶， TypeI仅有少量表达。研究发现TypeII只在人的大 脑中表达。
RNA的剪切修饰
RNA的剪切修饰
RNA的选择性剪切
一 概念 选择性剪切是指从一个mRNA前体 中通过不同的剪接方式（选择不同的 剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接 异构体的过程。 选择性剪切不仅仅是mRNA剪去内 含子的过程，还包括不同外显子之间 的组合过程
RNA的选择性剪切
1980年 Baltimore在小鼠 IgM 基因发现第一 个选择性剪接现象，不同外显子组合分别产 生膜型、分泌型IgM。 高通量的基因组测序和EST测序，使生物信 息学方法来研究选择性剪接成为可能。最近 研究结果显示，约35%－60%的人基因有选 择性剪接形式。
U1
U2
Splicing to mRNA
Transcriptome:
5’Exon Exon Exon 3’
RNA的剪切修饰


过去人们一直认为，基因的遗传密码子是连续 不断地并列在一起，形成一条没有间隔的完整 的基因体。但以后通过对真核蛋白质编码基因 结构的分析发现，在它们的核苷酸序列中间插 入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个 基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编 码序列不连续的间断基因为断裂基因。 在很多情况下，有内含子的基因首先转录成 RNA 前体，之后内含子被去除，外显子被拼接 到一起。成熟的mRNA只含有外显子序列。 我 们把内含子的删除过程称为RNA的剪接