2017-2018学年高中生物第三章酶的应用技术实践第8课时固定化酶的制备和应用同步备课教学案苏教版选修1

第8课时固定化酶的制备和应用[学习导航] 1.简述固定化酶的制作方法。

2.简述固定化细胞技术的应用及酵母菌细胞的固定化技术。

[重难点击] 1.简述固定化酶的制作方法。

2.简述酵母菌细胞的固定化技术。

一、固定化酶和制备固定化酶的常用方法1.固定化酶(1)概念：固定化酶是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。

(2)特点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用。

2.制备固定化酶的常用方法(1)物理吸附法是将酶吸附在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式，其显著特点是工艺简便且条件温和。

(2)化学结合法是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。

(3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中包埋成格子型，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中包埋成微胶囊型。

由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模地使用。

人们针对酶不能被广泛应用这一情况，一直在寻求改善方法，其中之一就是固定化酶技术的应用。

观察下图有关制备固定化酶的常用方法，结合教材回答下列问题：(1)图A为物理吸附法，它的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。

(2)图B为化学结合法，它是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。

(3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。

将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中(如图C)，包埋成格子型；或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中(如图D)，包埋成微胶囊型。

归纳提炼各种固定化酶方法的比较比较项目物理吸附法包埋法化学结合法制备易较难较难结合程度弱强强活力回收率高，但酶易流失高中等再生可能不可能不可能固定化成本低低中等底物专一性不变不变可变1.如图是酶的几种固定方式示意图，其所采用的固定方法依次是( )A.物理吸附法、化学结合法、包埋法B.化学结合法、物理吸附法、包埋法C.包埋法、物理吸附法、化学结合法D.包埋法、化学结合法、物理吸附法答案 D解析①图表示酶包埋在细微网格里，应属于包埋法；②图表示许多酶分子通过特殊载体连接起来，成交联网架结构，应属于化学结合法；③图表示将酶固定在一定的支持物上，属于物理吸附法。

2.下列关于固定化酶和一般酶制剂在应用效果上的说法，错误的是( )A.固定化酶可长久使用B.一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物的纯度不高C.一般酶制剂参加反应后不能重复利用D.固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量答案 A解析固定化酶是将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与底物接触，又能与产物分离；同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用，降低成本，产物中也不含酶，提高了产品的纯度。

固定化酶虽可以多次利用，但不可长久使用。

二、固定化细胞技术的应用1.固定化细胞的概念通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。

固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，可以像游离的细胞一样用于发酵生产。

2.应用：固定化细胞可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。

(1)在工业生产上，利用固定化植物细胞可以生产多种色素、香精、药物、酶等。

(2)利用固定化微生物细胞可以生产酒精、啤酒、谷氨酸、α－淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、青霉素、头孢霉素等。

(3)在医学上，利用固定化动物细胞可以生产小儿麻痹症疫苗、狂犬病疫苗、麻疹疫苗、肝炎疫苗、口蹄疫疫苗等，还可以生产生长激素、干扰素、胰岛素、催乳素、促性腺激素等。

(4)将固定化的胰岛细胞制成微囊，能治疗糖尿病。

(5)用固定化细胞制成的生物传感器可用于医疗诊断。

(6)在化学分析方面，可制成各种固定化细胞传感器，用来测定醋酸、乙醇和氨等。

(7)固定化细胞在环境保护、能源开发等领域都有着重要的应用。

3.固定化细胞技术的优点(1)固定化细胞技术无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。

(2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。

(3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。

(4)细胞生长停滞时间短，反应快。

正是由于固定化细胞的这些无可比拟的优势，尽管固定化细胞技术的出现远远晚于固定化酶技术，但它的应用范围比固定化酶更广泛。

4.固定化细胞技术的缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。

(2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到一定限制。

(3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。

5.细胞的固定化方法凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。

凝胶包埋法所使用的载体主要有海藻酸钠凝胶、琼脂、角叉菜胶、明胶等。

用海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。

6.酵母菌细胞的固定化技术的过程准备各种实验药品和器材―→制备麦芽汁―→活化酵母菌细胞―→配制物质的量浓度为0.05 mol/L 的氯化钙溶液―→制备固定化细胞―→浸泡和洗涤―→发酵麦芽汁。

分析下列酵母菌细胞固定化操作流程，回答问题。

准备各种实验药品和器材主要药品有：干麦芽粉、干酵母、聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠、无水氯化钙、蒸馏水、葡萄糖溶液、碘液↓制备麦芽汁干麦芽粉＋蒸馏水―――――→58～65 ℃放置3～4 h 麦芽汁―――――――――→煮沸、冷却、调pH 灭菌无菌麦芽汁 ↓活化酵母菌细胞干酵母＋蒸馏水→活化的酵母菌↓配制物质的量浓度为0.05 mol/L 的氯化钙溶液无水氯化钙＋蒸馏水↓制备固定化细胞聚乙烯醇(PVA)＋海藻酸钠＋蒸馏水――――――――→加热、冷却加入酵母菌培养液酵母菌—聚乙烯醇—海藻酸钠溶液――――→滴入氯化钙溶液中凝胶珠 ↓ 浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤待凝胶珠在溶液中浸泡30 min 后，取出并用蒸馏水洗涤3次备用↓发酵麦芽汁将凝胶珠加入无菌麦芽汁中1.在酵母菌细胞的活化和配制CaCl 2溶液时，都使用了蒸馏水，为什么不能使用自来水？ 答案 防止自来水中各种离子影响实验结果。

2.配制海藻酸钠溶液时加热是关键，为什么要用小火间断加热？答案 防止海藻酸钠溶液焦糊。

3.能否在刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母菌细胞？答案 不能，因为刚溶化好的海藻酸钠溶液温度较高，会将酵母菌细胞杀死。

归纳总结 (1)固定化细胞与固定化酶的主要区别①固定化细胞使用的是活细胞，因而为了保证其生长、增殖的需要，应该为其提供一定的营养物质。

②固定化细胞由于保证了细胞的完整性，酶的环境改变小，所以对酶的活性影响最小。

(2)凝胶珠的检测：刚形成的凝胶珠应在氯化钙溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。

检验凝胶珠的质量是否合格可以使用下列方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，且没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功；二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。

3.关于固定化酵母菌细胞制备过程的叙述，正确的是( )A.为使酵母菌活化，应让干酵母与自来水混合并搅拌B.用小火或间断加热可防止海藻酸钠溶液焦糊C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母菌细胞，充分搅拌并混合均匀D.将与酵母菌细胞混匀的海藻酸钠溶液倒入CaCl 2溶液中，会观察到CaCl 2溶液中有球形或椭球形的凝胶珠形成答案 B解析 酵母菌细胞活化时，应让干酵母与蒸馏水混合并搅拌，A 项错误；配制海藻酸钠溶液时要用小火或间断加热的方法，否则海藻酸钠会发生焦糊，B 项正确；刚溶化的海藻酸钠应冷却后再与酵母细胞混合，否则温度过高会导致酵母细胞死亡，C项错误；将与酵母菌细胞混匀的海藻酸钠溶液匀速滴入CaCl2溶液中，D项错误。

4.下面是制备固定化酵母菌细胞的实验步骤，请回答下列问题：酵母菌细胞的活化―→配制CaCl2溶液―→配制海藻酸钠溶液―→海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合―→固定化酵母菌细胞(1)在____________状态下，微生物处于休眠状态。

活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复__________状态。

活化前应选择足够大的容器，因为酵母菌细胞活化时____________。

(2)固定化细胞技术一般采用包埋法，而固定化酶常用__________和__________________。

(3)影响实验成败的关键步骤是__________________________________________________。

(4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________________________________________。

(5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞数目__________。

如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明_________________________________________________。

(6)该实验中CaCl2溶液的作用是_________________________________________________。

答案(1)缺水正常(生活) 体积会增大(增多)(2)化学结合法物理吸附法(3)配制海藻酸钠溶液(4)小火加热(或小火间断加热)，不断搅拌(5)较少(海藻酸钠浓度偏高)制作失败(6)使胶体聚沉(或形成稳定的结构)解析(1)酵母菌细胞在缺水的状态下休眠。

活化是加入水使酵母菌恢复到生活状态。

酵母菌细胞活化后体积会增大。

(2)固定化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。

(3)实验的关键是配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。

(4)海藻酸钠溶化过程要小火、且间断加热、并不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又不会发生焦糊。

(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就会过少；海藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。

(6)CaCl2溶液能使海藻酸钠发生聚沉，形成稳定的结构。

一题多变(1)固定酵母菌细胞的过程中三次使用到蒸馏水，请说出是哪三个环节？答案酵母菌细胞的活化、配制CaCl2溶液以及配制海藻酸钠溶液定容时需要使用蒸馏水。

(2)本题中固定酵母菌细胞使用了海藻酸钠，固定化细胞还可以使用哪些固定化材料？答案明胶、琼脂糖、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。

(3)制备好的固定化酵母菌细胞可以用于酒精发酵，如果酵母菌细胞没有活化或溶化好的海藻酸钠溶液没有冷却就加入了酵母菌细胞，则对酒精发酵会产生怎样的影响？答案如果酵母菌细胞没有活化，则仍处于休眠状态；如果溶化好的海藻酸钠溶液没有冷却就加入了酵母菌细胞，则酵母菌细胞会被高温杀死。