诱变物质的微核测试

诱变物质的微核测试
一、实验目的
1、了解细胞微核形成机理及其形态特点
2、学习植物根尖细胞的微核检测方法
二、实验原理
微核（micronucleus, 简称MCN），也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。

微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。

在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。

微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。

一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。

有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。

这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。

当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。

已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。

所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。

由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。

只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。

目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。

三、实验材料
蚕豆：又称胡豆、佛豆、胡豆、川豆、倭豆、罗汉豆。

一年生或二年生草本。

为粮食、蔬菜和饲料、绿肥兼用作物。

起源于西南亚和北非。

相传西汉张骞自西域引入中国。

蚕豆含8种必需氨基酸。

碳水化合物含量47％～60％。

营养价值丰富，可食用，也可制酱、酱油、粉丝、粉皮和作蔬菜。

还可作饲料、绿肥和蜜源植物种植一年生或二年生草本。

茎直立，四棱，中空，四角上的维管束较大。

羽状复叶。

总状花序，花蝶形。

荚果，种子扁平，略呈矩圆形或近于球形。

蚕豆花期一般是3月~5月。

蚕豆为长日照作物。

喜温暖湿润气候和pH6.2～8的粘壤土。

器材:显微镜、培养皿、恒温培养箱、滤纸、生物解剖器、250ml、1L容量瓶、玻璃棒、点滴板、载玻片、盖玻片等。

药品：盐酸、冰醋酸、龙胆紫染液、乙醇、70%酒精、重络酸钾、蒸馏水
1.1实验方法
1.1.1选种→浸种→催芽→处理
选取颗粒饱满、色泽均匀的蚕豆种子作为实验材料。

将选取好的蚕豆种子臵于培养皿中加蒸馏水浸种24小时，期间换水2次。

将浸泡24小时之后的蚕豆种子臵于25℃恒温培养箱中培养，直至生根1-2cm。

称取1g重铬酸钾溶于蒸馏水中，转入1L容量瓶中定容。

将生根1-2cm的蚕豆分成16份，分别用1g/L重铬酸钾溶液、0.5 g/L重铬酸钾溶液（用1g/L重铬酸钾溶液稀释）、0.25 g/L重铬酸钾
溶液（1g/L重铬酸钾溶液稀释）处理，对照用自来水处理。

（每个处理均为4份）。

1.1.2蚕豆根尖微核试验（半数保留，恢复培养24小时后进行此项）
1.1.
2.1先用卡诺氏固定液固定，后解离、染色、制片观察
卡诺氏固定液的配制： 3乙醇：1冰醋酸
解离液的配制： 1盐酸：1乙醇
固定：切取1cm左右的根尖，用卡诺氏固定液固定24小时后弃去固定液，移入70%酒精中保存。

解离：弃去固定液，用蒸馏水漂洗2次，吸净水，加入解离液解离20分钟，弃去解离液，蒸馏水漂洗2次。

染色：截取1-2mm蚕豆根尖于点滴板内，滴加适量的龙胆紫染色液染色10分钟，加盖玻片，压片观察，记录有微核的细胞数目。

1.2.2.2直接解离、染色、制片观察
解离：切取1cm左右的根尖，用蒸馏水洗2次，吸净水，加入解离液解离20分钟，弃去解离液，蒸馏水漂洗2次。

染色：截取1-2mm蚕豆根尖于点滴板内，滴加适量的龙胆紫染色液染色10分钟，加盖玻片，压片观察，记录有微核的细胞数目。

1、数据统计与分析
2.1微核形成与识别：首先在低倍镜中找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察，找到微核。

（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。

（2）小核着色与主核相当或稍浅。

（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。

不同物质对蚕豆根尖细胞微核的诱导效应
以蒸馏水和重铬酸钾溶液处理蚕豆根尖后，观察并计算其微核形成率。

镜检发现微核位于细胞质中，为与主核完全分开的圆形或椭圆形核，大小约为主核的1/3，其染色程度与主核一致或略浅于主核。

分析表明，不同处理对蚕豆根尖细
胞微核的诱导随处理液不同而存在差异。

不同处理蚕豆根尖细胞后的微核率在2‰～10‰之间。

结果表明，重铬酸钾溶液诱导蚕豆根尖细胞产生的微核率显著高于蒸馏水（P<0.05）。

3.2不同浓度重铬酸钾溶液对蚕豆根尖细胞微核的诱导效应
以三种不同浓度的重铬酸钾溶液（1g/L重铬酸钾溶液、0.5 g/L重铬酸钾溶液、0.25 g/L重铬酸钾溶液）处理根尖，观察并计算其微核率。

结果表明，处理24小时后，微核率随着重铬酸钾溶液浓度升高，其中3个处理组与对照组差异显著（P＜0.05），且B1、C1和D1之间也存在差异性（P<0.05），具有明显的质量浓度关系,即重铬酸钾溶液浓度越高，蚕豆根尖细胞微核率也越高。