高效液相色谱法培训课件优秀课件
合集下载
高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
《高效液相色谱培训》课件
讲解色谱柱的分类、特点以及如何选择合适的色谱柱。
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
waters-e高效液相色谱ppt课件
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
HPLC高效液相色谱培训__PPT
HPLC的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程 中改变流动相的组成或浓度。 高压梯度 ①线性梯度; ②阶梯梯度 低压梯度
22
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
优点：只要通过梯度程序 控制器控制每台泵的输出， 就能获得任意形式的梯度 曲线，而且精度很高，易 于实现自动化控制。 缺点：使用了两台高压输 液泵，使仪器价格变得更 昂贵，故障率也相对较高， 而且只能实现二元梯度操 作。
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography ，HPLC
1
Tanghui.pha.shzu
第一节 概 述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术， 随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广 泛的化学分离分析的重要手段。
10
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
11
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
1．高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流 动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。
28
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填 料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成 匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液 的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
22
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
优点：只要通过梯度程序 控制器控制每台泵的输出， 就能获得任意形式的梯度 曲线，而且精度很高，易 于实现自动化控制。 缺点：使用了两台高压输 液泵，使仪器价格变得更 昂贵，故障率也相对较高， 而且只能实现二元梯度操 作。
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography ，HPLC
1
Tanghui.pha.shzu
第一节 概 述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术， 随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广 泛的化学分离分析的重要手段。
10
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
11
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
1．高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流 动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。
28
Tanghui.pha.shzu
第二节 高效液相色谱仪器
柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填 料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成 匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液 的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 一般柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
高效液相色谱法教学精【全】ppt课件
§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
安捷伦1260高效液相色谱培训课件
C、一般情况下色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱 可以反冲时，才可以反冲除去柱内杂质，否则反冲会 迅速降低柱效。
D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固 定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入 分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基 质被溶解。
概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。
•9 •安捷伦1260高效液相色谱培训
E、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接进入柱内， 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一 个保护柱，保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以 经常更换。 F、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质 G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接
•4 •安捷伦1260高效液相色谱培训
2、输液泵的使用和维护注意事项 A、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质 微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先 除去流动相中的任何固体微粒； B、流动相不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应 保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如 果含有缓冲溶液的流动相在柱内，由于蒸发或泄漏，甚至 由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将 损坏密封环和柱塞等。因此，仪器在关机前必须将泵清洗 干净，再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。 C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空 泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值，否则会 使高压密封环变形。 E、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的 稳定。
D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固 定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入 分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基 质被溶解。
概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。
•9 •安捷伦1260高效液相色谱培训
E、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接进入柱内， 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一 个保护柱，保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以 经常更换。 F、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质 G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接
•4 •安捷伦1260高效液相色谱培训
2、输液泵的使用和维护注意事项 A、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质 微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先 除去流动相中的任何固体微粒； B、流动相不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应 保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如 果含有缓冲溶液的流动相在柱内，由于蒸发或泄漏，甚至 由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将 损坏密封环和柱塞等。因此，仪器在关机前必须将泵清洗 干净，再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。 C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空 泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值，否则会 使高压密封环变形。 E、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的 稳定。
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类
烷基磺酸盐——用于碱类
离子色谱法（ ion chromatography ）
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自
检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相
过滤，脱气 色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um
高效液相色谱法培训课件
第一节 概述
高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的 理论与实验方法，流动相用高压泵输送， 采用高效固定相和在线检测等手段发展而 成的分离分析方法 。
与气相色谱法相比具有：适用范围广，样 品预处理简单，分离效率高，流动相选择 范围广，检测方法多为非破坏性的，流出 组分可回收等优点。
用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
空间排斥色谱（steric exclusion ）
也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸 与凝胶空径大小之间的相对关系而分离， 类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸 内，分子越大，保留时间越短。
间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
第二节 高效液相色谱仪
高压泵
流 动 相
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
高效液相色谱仪组成
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统
液相色谱流程图
溶剂
HPLC色谱柱
数据处理系统
chromatography）。
手性色谱(chiral chromatography)
用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类：
直接法
手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)
手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕
量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平 衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有 差异, 可能会引起基线漂移
1．梯度洗脱的特点
2．梯度洗脱的主要条件
① A 流动相/弱溶剂组成； ② B 流动相/强溶剂组成；
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。
常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
pH变化值 0.1
液相柱---保留值与pH的关系
RS变化值 1.6
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
对溶剂的要求
水： 去离子水
自动纯水仪
纯净水
商品瓶装水
溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
试剂: 分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um
的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使
液-固吸附
正相色谱 一般反相色谱
液-液分配
反相色谱 离子对色谱
键
离子抑制色谱 一般离子交换色谱
合 相
色
离子交换色谱 离子色谱
谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
凝胶渗透——以有机溶剂为流动相
凝胶过滤——以水溶液为流动相
对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
胶束色谱(micellar chromatography) 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓
度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚 集而成胶束（胶粒）。 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶 束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体 系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。 因胶束色谱法的流动相是多相分散体系， 在整个色谱体系中又增加了一相，故也被 称为假相色谱（pseudo phase
常用反离子有：季铵盐 ——用于酸类
烷基磺酸盐——用于碱类
离子色谱法（ ion chromatography ）
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自
检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相
过滤，脱气 色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um
高效液相色谱法培训课件
第一节 概述
高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经 典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的 理论与实验方法，流动相用高压泵输送， 采用高效固定相和在线检测等手段发展而 成的分离分析方法 。
与气相色谱法相比具有：适用范围广，样 品预处理简单，分离效率高，流动相选择 范围广，检测方法多为非破坏性的，流出 组分可回收等优点。
用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
离子色谱是由经典的离子交换色谱 发展起来的一种液相色谱技术，利 用物质在离子交换柱上迁移的差异 而达到分离，用于亲水性阴阳离子 的测定。根据是否采用抑制柱，可 分为抑制型离子色谱和非抑制型离 子色谱。
空间排斥色谱（steric exclusion ）
也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸 与凝胶空径大小之间的相对关系而分离， 类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸 内，分子越大，保留时间越短。
间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)
第二节 高效液相色谱仪
高压泵
流 动 相
脱气装置
进 样 阀
色 谱 柱
检测器
高效液相色谱仪组成
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据记录处理系统
液相色谱流程图
溶剂
HPLC色谱柱
数据处理系统
chromatography）。
手性色谱(chiral chromatography)
用于分离手性药物对映体的一种有效技 术，可分为直接法和间接法两类：
直接法
手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)
手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕
量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平 衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有 差异, 可能会引起基线漂移
1．梯度洗脱的特点
2．梯度洗脱的主要条件
① A 流动相/弱溶剂组成； ② B 流动相/强溶剂组成；
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。
常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
常用流动相为甲醇-水，乙腈-水。
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
pH变化值 0.1
液相柱---保留值与pH的关系
RS变化值 1.6
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
对溶剂的要求
水： 去离子水
自动纯水仪
纯净水
商品瓶装水
溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
试剂: 分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um
的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使
液-固吸附
正相色谱 一般反相色谱
液-液分配
反相色谱 离子对色谱
键
离子抑制色谱 一般离子交换色谱
合 相
色
离子交换色谱 离子色谱
谱
HPLC
氨基酸分析
空间排斥色谱
凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
假相色谱
胶束色谱 环糊精色谱
亲合色谱，手性色谱，毛细管电泳
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
凝胶渗透——以有机溶剂为流动相
凝胶过滤——以水溶液为流动相
对于相同化学组成的高分子化合物，其分 子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色 谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
胶束色谱(micellar chromatography) 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓
度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚 集而成胶束（胶粒）。 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶 束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体 系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。 因胶束色谱法的流动相是多相分散体系， 在整个色谱体系中又增加了一相，故也被 称为假相色谱（pseudo phase