叶绿素a、b含量测定

叶绿素a、b含量测定
【实验原理】
如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。

叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。

根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下的关系：
OD1=C a·k a1+C b·k b1（1）
OD2=C a·k a2+C b·k b2（2）
式中：C a为组分a的浓度，g/L；C b 为组分b的浓度，g/L；
OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值；OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值；k a1为组分a的比吸收系数，即组分a当浓度为1g/L时，于波长λ1时的光密度OD值；
k a2为组分a（浓度为1g/L），于波长λ2时的光密度OD值；
k b1为组分b（浓度为1g/L），于波长λ1时的光密度OD值；
k b2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为1g/L时，于波长λ2时的光密度OD值；
从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下：
波长（nm）叶绿素a叶绿素b
66382.049.27
64516.7545.60
将表中数值代入上式（1）、（2），则得：
OD663=82.04×C a+9.27×C b
OD645=16.75×C a+45.60×C b
经过整理之后，即得到下式：
C a=0.0127 OD663-0.00269 OD645
C b=0.0229 OD645-0.00468 OD663
如果把C a，C b的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：C a=12.7 OD663-2.69 OD645（3）
C b=22.9 OD645-4.68 OD663（4）
C T= C a+ C b=8.02 OD663+20.21 OD645（5）
（5）式中C T为总叶绿素浓度，单位为mg/L。

（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度（mg/L）。

利用上面（3）、
（4）、
[附注]由于叶绿素a和b吸收峰的波长相差仅18nm（663-645nm），对仪器的波长精确度要求较高，一般低级类型的分光光度计难以满足要求，至少要中级或高级类型的。

而有时还由于仪器受振等原因，会使仪器的标称波长与实际波长不符，测定的正确性就差了。

如果对测定结果发生疑问时，不妨用已知波长的滤光片验证一下，仪器的波长是否正确，如无滤光片，可用商品叶绿素a或b（厂家会标明λmax 数据），对仪器的波长进行验证。

由于所需的叶绿素a或b的量很少，又无正确浓度要求，因此不妨自行制备，用纸层析法很快就能分离得到。

【器材与试剂】
1. 实验仪器高级型分光光度计、离心机、台天平、剪刀、研钵、漏斗、移液管
2. 实验试剂丙酮、碳酸钙
3. 实验材料植物叶片
【实验步骤】
1. 色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5 g放入研钵中加纯丙酮5 mL，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5 mL，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清夜用80%丙酮定容至20 mL。

2. 测定光密度：取上述色素提取液1 mL，加80%丙酮4 mL稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm、645nm处的光密度值。

3. 按公式（3）、（4）、（5）分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b、及叶绿素a+b的浓度。

再根据稀释倍数分别计算每g鲜重叶片中色素的含量。

【注意事项】
1. 由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。

2. 由于叶绿素a、b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。