荧光染料

荧光染料——黄绿色激光（532-561nm）激发篇
荧光素名称激发光
(nm)最大发射光
(nm)
相对荧光
强度
荧光素名称
Alexa Fluor® 5325325613推荐滤片：560/14 带通
不易淬灭，适用于荧光显微镜
R-PE
(R-Phycoerythrin)532 - 5615785推荐滤片：575/26 带通
高量子产率，适用于低表达蛋白，易淬灭，不适用
于荧光显微镜
PE-eFluor® 610532 - 561607 3 to 4推荐滤片：610/2带通
用于替代PE-Texas Red®，比其亮度高.
PE-Cyanine 5532 - 5616674推荐滤片：670/14带通
与APC同时使用时干扰很大，此时可用PE-Cyanine
5.5替代
PE-Cyanine 5.5532 - 561695 3 to 4推荐滤片：695/40带通
可以与APC一起使用
PE-Cyanine 7532 - 5617853推荐使用：780/60带通滤片
与常用荧光素的补偿较小
荧光染料——紫色激光（405nm）激发篇
荧光素名称激发光(nm)最大发射光
(nm)相对荧光强度
(1 为最低,
5 为最高)
用途
eFluor® 4504054502推荐滤片：450/50带通.
用于Pacific Blue®.
可与eFluor® 605NC 或
eFluor® 625NC一起使用，注
意后两者仅用于表达高的蛋白eFluor® 605NC4056052推荐滤片：605/40带通
比Pacific Orange®更亮，但
滤片稍有差异
eFluor® 625NC4056252推荐滤片：605/40带通
用于表达高的蛋白
eFluor® 650NC4056503推荐滤片：660/40带通
用于表达高的蛋白
荧光染料——红色激光（633nm）激发篇
荧光素名称激发
光 (nm)最大发射光
(nm)
相对荧光强度
(1 为最低,
5 为最高)
用途
APC (Allophycocyanin)6336604推荐滤片：660/20 带通
与Cy5和Alexa Fluor® 647
光谱相同，可互相替代eFluor® 6606336604推荐滤片：660/20 带通
eFluor® 660 用于替代Alexa
Fluor® 647和APC
不易淬灭，特别适合荧光显微镜
Alexa Fluor® 6476336684推荐滤片：660/20 带通
用于替代Cy5和APC
不易淬灭，特别适合荧光显微镜Cy56336703推荐滤片：660/20 带通
可以与APC 或Alexa Fluor®
647互相替代
适用于胞内染色和显微镜观察Alexa Fluor® 7006337232需配置685 LP 透镜和710/20
带通滤片，请与仪器提供商核
实。

红光不是其最适的激发光，但激
发后信号还是很强，可作为第三
选择。

APC-eFluor® 7806337802推荐滤片：780/60 带通
替代APC-Cy7和APC-Alexa
Fluor® 750，不易淬灭.
荧光染料——蓝色激光（488nm）激发篇
荧光素名称激发
光 (nm)最大发射
光(nm)
相对荧光强度
(1 为最低,
5 为最高)
用途
FITC (Fluorescein
Isothiocyanate)4885183
推荐使用：530/30 带通滤片
也可以用于荧光显微镜
Alexa Fluor® 4884885193推荐使用：530/30 带通滤片
光稳定性好，用于荧光显微镜的更好选择
R-PE
(R-Phycoerythrin)4885785
推荐使用：575/26 带通滤片
适用于低表达抗原的流式检测
适用于荧光显微镜，但容易淬灭（流
式检测不受影响）
PE-eFluor® 610488607 3 to 4推荐使用：610/20 带通滤片
用于替代PE-Texas Red®，荧光更强
PE-Cyanine 5
(PE-Cy5)4886674
推荐使用：670/14带通滤片
与APC同时使用时干扰很大，此时可
用PE-Cyanine 5.5替代
PE-Cyanine 5.5
(PE-Cy5.5)488695 3 to 4
推荐使用：695/40带通滤片
可以与APC一起使用
PerCP-Cyanine 5.5
(PerCP-Cy5.5)4886953
推荐使用：695/40带通滤片
可以与APC一起使用
PerCP-eFluor®
7104887104
推荐使用：710/50带通滤片
可以与APC一起使用，亮度是
PerCP-Cyanine 5.5的2~3倍
PE-Cyanine 7
(PE-Cy7)4887853
推荐使用：780/60带通滤片
与常用荧光素的补偿较小
7-AAD488647--推荐使用：670/14带通滤片选择性结合DNA的GC区用于死活细胞鉴定
Propidium Iodide
(PI)
488617--
推荐使用：575/26带通滤片
DNA嵌入性染料
用于死活细胞鉴定
TC(PE-Cy5)/PE-Cy5.5与PerCP/PerCP-Cy5.5的比较
多色分析越来越成为流式细胞术的主流，这就必然涉及到荧光染料的选择和搭配。

FITC和PE是常规的FL1和FL2通道所用染料，那么第三色和第四色究竟应该用什么染料，是TC(PE-Cy5)、PE-Cy5.5还是PerCP或PerCP-Cy5.5。

TC(PE-Cy5)和PE-Cy5.5具有以下优点：
荧光亮度由强到弱的排列顺序为：PE-Cy5.5>TC(PE-Cy5)>PerCP-Cy5.5>PerCP；
PE-Cy5.5可用HeNe(氦-氖)或红色二极管激光器激发，因此非常适用于配置多激光器的流式细胞仪；TC(PE-Cy5)和PE-Cy5.5兼容于大部分流式细胞仪，既可用于小功率激光器的小型流式细胞仪，又可用于大功率激光器的流式细胞分选仪。

BD FACSCalibur 机器四色补偿调节
流式细胞仪四色检测日趋成为当今流式临床检测和科学研究的常用手段, 其应用包括检测Th1/Th2细胞亚群,白血病免疫分型和微小残留(MRD)等。

更重要的是,对于科研工作者,同时应用的抗体越多,所能探测到的细胞亚群则越详细,其意义弥足珍贵.
对于1998年以后的Coulter EPICS XL型流式细胞仪,均配置为单激光四个荧光检测通道,即可用单个激光(488nm 氩离子激光器)激发四种荧光染料,包括FITC, PE, PE-TR(或ECD为Coulter的注册商标),TC(TC为美国Caltag公司的注册商标,其与PE-Cy5等同),对细胞进行四个荧光参数的同时检测.虽然PE-TR与PE之间的补偿比较大,有时可达50%以上,但如果仔细调节,还是能收到比较好的效果。

而BD(Beckton Dickinson)公司的流式细胞仪则不同,其在早期即配置了四个检测通道,但不是由单个激光激发,而是由两个激光器激发,一个为488nm氩离子激光器,可激发FITC, PE和PerCP(BD的注册商标)[PerCP可被TC或PE-Cy5所替代].另一个为633nm的氦氖激光器,可激发APC.BD FACSCalibur机器即为此种配置,且具有软件调节补偿的作用, 可很好地调节FITC, PE, PerCP及APC间的补偿.但由于PerCP标记的荧光抗体种类比较少,所以在实践过程中多用TC(PE-Cy5)标记的抗体来替代。

然而在使用PE-Cy5时，会经常发现补偿十分难调，PE-Cy5与APC间的补偿甚至超过90%, 有时根本无法调好。

这是因为PE-Cy5为"tandem"(阵列)型荧光染料，PE与Cy5依靠能量转移(Energy Tansfer)来实现荧光的激发与发射。

而我们知道能量转移的效率有赖于两种分子间的距离，如距离稍有增加，则能量转移效率则会大幅下降，也就是说，PE-Cy5将分裂成两种染料，PE和Cy5。

Cy5与APC具有相似的激发波长，在BD FACSCalibur机器中均可被第二个激光器所激发，因此造成补偿难调的情况。

那么如何解决上述问题呢？"诀窍"有几个：
滴定降低PE-Cy5抗体的使用浓度,使得在不影响抗原检测的同时,得到较好的补偿调节PMT(光电倍增管)的电压(HV)，方法是:提高FL3通道的PMT电压，用以检测PE-Cy5。

同时降低FL3通道的PMT 电压，用以检测APC。

目的是使在FL4通道中尽量减少对Cy5的检测量。

使用美国Caltag公司PE-Cy5.5标记的抗体来替代PE-Cy5标记的抗体，可以非常好的解决此问题。

如其公司网站 上的PE-Cy5.5 Tandem Dye for Use in Multi-Color Flow Cytometry - flyer 所述,PE-Cy5.5与APC间的补偿仅为 1.0%，非常的小。

而且，PE-Cy5.5可与PE-Cy5,PE-TR,PE-Cy7等染料一起实现对细胞进行单激光6色的同时检测和分析。

因此是最为推荐的解决方法。

解决原理为PE-Cy5.5虽然也属"阵列"型染料，但Cy5.5比Cy5的激发波长要长得多，在700nm左右，因此可激发APC的第二激光器(633nm)无法激发Cy5.5,使得PE-Cy5.5与APC间的补偿非常小。

补偿是否容易调节还与PE-Cy5标记抗体的特异性和供应厂商有关。

有研究表明，使用美国Caltag 公司的CD5-TC时，TC与APC间的补偿比较难调，而用该公司TC标记的其它抗体，如CD19, MAC-1和HLA-DR等则比较容易调节补偿 .。