高效液相色谱讲座Ⅵ化学键合相色谱(上)

化，峰形对称，对溶剂中微量水分含量的变化要求 不苛刻；此外，溶剂的残留效应小，梯度冲洗平衡 快，和液固吸附色谱相比较，流动相性质可以比较
缓和 ，柱 子不 “ 娇” 。
至今尚无商品供应。 ３ ｉ 键型 （ ．Ｓ－Ｃ 硅胶与卤代烷反应产物） 从氯化硅胶 （ 反应２ ）开始，利用格氏反应引
入烷基 ；
（ ） 耐溶剂冲洗。这是传统的液液分配色谱 ２
Ｃ Ｈ３ １ ７ ８ ，ＹＱ Ｃ６ ＭＣ Ｏ 柱上，这个比值 Ｇ－ １及Ｙ － ＤＳ 分别为１ ９，． ２ ． ７说明一氯硅烷键合的填 ． ７１ ０和１ ０ ０ ７ ７ 料 （ 后两种）比三氯硅烷 （ 第一种）残余羟基少。 光谱法也是考察填料表面羟基含量 的 重要手
段 。这 是基于Ｓ－ Ｏ ｉ Ｈ基 在３５ｃ １ ７０ｍ 处有 特征的红
离子交换键 合相 几类 ，这是 高效液相 色谱工作者 最
关心的问题。表 ６３列出了常用的某些代表性微粒 － 型化学键合固定相的理化性质。
１ 极性键合相
极性键合相一般指键合有机分子中含有某种极 性基团，和空白硅胶相比，这种极性键合相的表面 上能量分布相对均匀，因而吸附活性也比硅胶低， 可以看成是一种改性过的硅胶。常使用正相操作，
６ ３ － 分 类 化学键合相的分类可以有不同的依据，例如按 键合相基质分有硅胶和非硅胶担体的，有全孔的和 表面多孔层的。仅就目 前用得最广的全孔微粒硅胶 基质为例，也有形状 （ 球形和非球形）、粒度、孔 结构的区别。５ １ ０ｍ粒度、６ １ｎ ０ｍ孔径的球形 和无定形硅胶是键合相的主要基体原料。上一节我 们介绍了几种不同的键合方法，本节着重讨论按键 合有机硅烷的官能团分类，可分为非极性、极性和
有机硅烷分子中Ｒ基是赖以区分不同类型键合相的 基础， 基可以是非极性的、极性的或离子交换基 团，一般生产厂家都明确标示出来 （ 参见表６３。 － 在制备键合相时，首先基质硅胶一般需要酸处
表６２ － 硅烷化化应时间和温度对产物键合量的影响
理， 面的硅氧烷键打开，形成尽 使表 可能多的自由
羟基，有利于反应。酸处理也可以除去表面层的金 属氧化物杂质和孔隙中的细粉。在２０ 下烘干除 ０℃ 去物理吸附水。为了获得 “ 刷子型”单分子层键合 相，硅胶、硅烷、溶剂和反应器要严格脱水，反应 一般在升温下进行，然后依次用苯、丙酮、甲醇洗 涤或抽提。为了使键合有机分子完全 复盖 硅胶表 面，一般使用过量的硅烷试剂。三氯、二氯和一氯 硅烷的反应活性依次降低；而氯硅烷一般又比烷氧 基硅烷活泼得多。硅烷和硅胶的反应程度随反应温 度和时间而变，一般在制备中容易找出反应完全又 易于重复的反应条件。例如表 ６２列出了一种十八 － 烷基键合硅胶（ ＤＳ性能与反应条件的关系〔 Ｏ ３。 所用硅胶为Ｐａｔｉ ｒｉｌ ｓ ，比表面积４２ ０ｍ ２ｇ，硅烷为十
这种键合相的热和化学稳定性均比酯化型要好，但 仍不如后来的Ｓ－Ｏ－Ｓ－Ｃ键型，因而这个类型 ｉ ｉ
硅胶表面上已反应的硅醇基与反应上的硅烷摩尔数 之比Ｆ在１ ２ 之间。由于结构原因三个Ｘ都与硅醇
基反应的可能性几乎不存在。未反应的Ｘ可以水解 成羟基或与邻近键合有机分子交联，也可以与所用 硅烷聚合，取决于反应条件。 对单官能团硅烷，只可能有如（ ） ５ 式一种反应 方式，不可能产生聚合，也不可能产生新的游离羟 基，是比较理想的一种硅烷化试剂。 反应体系中如控制适量水分，对双、三官能团 硅烷可能产生聚合型的键合相：
能影响很大，它可以减小表面的疏水性，能对极性
化合物， 特别是碱性溶质产生二次化学级附， 使溶质
在两相间的平衡速度减慢，降低了键合相填料的化 学稳定性，而残余腔基浓度的变化又是产品性能不 重复的重要原因。所以除了对键合反应本身进行改 进之外，键合反应结束后，一般都要用三甲基氯硅 烷（ ＭＣ Ｔ Ｓ或六甲基二硅胺 ＨＭＤＳ 等小分子硅 烷进行处理，即封尾 （ ｄｃｐｉ ，以尽量减少 ｅ －ａｐｎ ｎ ｇ 残余羟基，这对提高键合相填料的稳定性是很重要 的。 另一方面， 也有一些ＯＤＳ 商品填料是不封尾的， 为的是增加与水系统流动相有更好 “ 润湿”性能。 以硅胶为基质的化学键合相可以认为是一种改 性硅胶 （ 其他基体键合相也一样），表面改性的完 全程度和重复性 （ 通过残余羟基、复盖度和复盖均
溶剂的范围。
从理论上讲，这种键结构有更好的稳定性，特别是 对微碱性的流动相，而且 Ｒ基 可 以按要求多次氯 化， 形成聚烷基键合相，但因制备上的困难，也无 商品出售。以上三种一般均形成 “ 刷子型”的键合
相。
４ Ｓ－Ｏ－Ｓ－Ｃ ． ｉ ｉ 键型 （ 硅胶与有机硅烷反
应产物）
这是一类 目前占绝对优势的键合相类型，具有 良好的热和化学稳定性，能在ｐ Ｈ＝２ ７ 的介质中 ． ５ 使用。它是利用氯或烷氧基硅烷与硅胶的反应：
判 断。
这里假定硅胶表面可反应的硅 醇 基 数 目为５ 个／ ｎ ２ ６ ２ １１ ｍ ． ０ ０为以微摩尔为基准的阿佛加德罗常 ７
数。
键合相的性能用色谱方法评价这是很自然的， 因为这是它的最终用途所在，所以生产厂家一般都 给产品附上特定标准物的保留值和柱效率或其他参 数的测试结果。在这里我们暂不讨论这些，因为一 般说来，为了标明某种固定相的特点，总是在理想 条件下进行测试，例如，对反相填料在 甲醇／ 水条 件下考察对稠环芳烃的分离情况。而我们这里的目 的是要通过色谱评价，发现不同键合相填料性质差 异的原因。 Ｕ ｇｒ４提出用非极性键合相填料正相冲洗的 ｎｅ 〕 方法检查残余羟基的含量，即用庚烷做流动相，若 残余羟基甚少，则像甲醇、 乙醚、 丙酮等极性化合物 的保留时间与ｔ相近，且峰形比较对称，溶质的保 ０ 留时间对庚烷中微量水的多寡不敏感；若残余羟基 多，则情况相反。Ｖ ｒｅ 〕 出对反相填料用甲 ｅｚｌ 提 ｅ５
匀性表示）是色谱用户和制造厂家共同关心的。测 定和表征的方法有微量元素分析、色谱、光谱、核 磁共振等，简单介绍如下。 微量元素分析或热失重法可以直接测定键合相 的碳含量（ ％Ｃ ， 对商品键合相， 这个值在２ ２％ ％ ９ 之间变化。由于％Ｃ 随基质比表面积 Ｓ 和键合有 ） 机基团的分子量（ 变化，故在研究和比较工作中 Ｍ） 多采用表面键合相浓度 表示，定义为
外吸收谱带， 借此可获得某些信息〔 Ｌｏｈ ｅｅ ６。 ｃｍｕｌｒ ｌ
等 ７ 人〔用荧光光 考 含 荧 发 基 芘 〕 谱 察了 有 光 色 团的
的有机硅烷与硅胶制备的键合相。发现键合基团在 填料表面复盖得并不均匀，键合的有机分子簇拥在 某些活性中心密集的地方。因而提出了在制备键合 相时首先应当使硅胶表面预钝化，以获得较均匀的
八烷基三氯硅烷，干 燥甲苯做反应溶剂，浓度
１％。由表可见在一定范围内延长反应时间和提高 ０ 反应温度有利于提高键合量。 由于空间位阻的缘故，较大的硅烷分子不可能 与担体表面上较小的硅醇基全部发生反应，因而残 余羟基是不可避免的，加之当使用双或三官能团硅 烷化试剂时，还可能有新生的硅醇基产生。这些残 余羟基，特别是在反相填料的情况下，对产品的性
讲
座
高 效 液 相 色 谱 讲 座
化 学 键 合 相 色 谱 （ 上）
王俊德 商振华
（ 中国科学院大连化学物理研究所）
来自百度文库
６ －１ 意义和特点
化学键合相色谱使用的固定相是借助于化学反 应的方法将有机分子以共价键连接在色谱担体上， 主要用于反相、正相和部分离子交换及空间排斥色 谱中。据统计 ，键 合相 色谱在高效液相色谱的 整个应用中占８％左右。表 ６１的数据表明它是近 ０ － 代柱液相色谱中最重要的一个类型。
表面复盖层 。
式中Ｗ为 １ 克担体上键合有机物的重量 μ 蘥 ｇ，用碳
含 量表示亦可写成
式中Ｎ 为键合有机基团的碳数，１为Ｃ ｃ ２ 原子量，文 献上报道的键合相浓度大部分为 ＝２ ４ ～ 。有时也
用表面 复盖 度表示键 合量：
Ｂａｅ等人〔〕 Ｓ和１ 交互极化和魔角旋转 ｙｒ ８用２ ｉ ３ Ｃ 固态核磁共振谱考察了若干化学键合相填料的表面 特征，能对填料的键合方法和后处理 （ 封尾）做出
即 键合相本身极性小的流 用比 动相冲洗。最常 用的
有氰基 （ Ｃ Ｎ或ｃａｏ 、二醇基 （ Ｉ ｙｎ Ｄ ＯＬ 、 氨基（ Ｎ ，ｍｎ ）等 （ Ｈ２ ｉｏ ａ 见表６３ 。 － 氰基键合相的分离选择性与硅胶相似，但因极 性比硅胶弱，所以在相同流动相条件下的保留值较 硅胶小，或者要维持相似的保留值，可用极性更小 的流动相冲洗。许多在硅胶上的分离可用氰基相完 成。它的优点是在梯度冲洗或流动相组成改变时平 衡快。由于键合过程中许多Ｓ－Ｏ 基被－Ｃ ｉ Ｈ Ｎ基 取代，因而和溶质间的不可逆化学吸附或副反 应
３ 热稳定性好。这一点在气相色谱中很重 ） 要，例如十八烷做为固定液，只能在常温下使用， 但十八烷基键合相的流失温度在 ２０ 以上。在高 ０ 效液相色谱中，热稳定性也有一定的意义，因为某 些分离就是在升温条件下进行的。 （ ） 表面改性灵活，容易获得重复 性 的产 ４ 品。改变键合用有机硅烷，可以得到不同键合相的 填料；控制硅胶的质量和键合工艺，便于工业规模 制备键合相。
式中Ｘ为Ｃ、 Ｈ Ｏ或Ｃ Ｏ ｌ Ｃ ２５ 基Ｒ，Ｒ２ 可以同Ｘ， 也可以是甲 基。即硅烷可以是单官能团或双、三官
能团反应 分子。
６２ － 制备和表征
根据键合有机分子的结构，可以有下列几种键
合反应类 型：
对双、三官能团硅烷有
１ Ｓ－Ｏ－Ｃ ｉ 键型（ 硅胶与醇类的反应产物）
这个セ化产物的典型商品填料是 ＨＰ Ｌ 发展初期 使用的，如国外的Ｄｕａａ ｒ ｋ和天津的ＨＤＧ ｐ 系列。 在有水、醇存在下，有水解和醇解的可能，所以只 能在正相条件下使用。 ２ Ｓ－Ｎ ｉ 键型 （ 硅胶与胺类的反应产物）
取代，某些离子型的物质也从用传统的离子交换树
脂分离改用离子交换键合相或反相 离子对色谱操 作。不仅如此，化学键合相也在气相色谱和薄层色 谱中广泛应用。归纳起来，化学键合相主要有以下 几个优越性。 （ ） 在很大程度上减弱了表面活性作用点， １ 清除了某些可能的催化活性。这样就缓和了一些复 杂样品在表面上的不可逆化学吸附，使 得 操 作简
要形成化学键合固定相， 有两个必要条件： 一是 所用的基质材料应有某种化学反应活性，例如许多 ３５ 价金属氧化物表面都具有化学反应的官能团， 像硅胶、 氧化铝、 硅藻土等。但以硅胶为最理想和最 常用。二是有机液相分子应含有能与基质表面发生 反应的官能团（ 详见下节）硅胶（ｉ ２ Ｈ２ 之所 。 ＳＯ ・ Ｏ） ｘ 以是理想的化学键合相基体，主要由它的表面性质 所决定。硅胶的体相结构呈硅－ 氧四面体 的晶 体点 阵，而在表面相这种点阵突然中断，表面硅原子可 酝通过硅醇基 （ Ｓ－Ｏ ｉ Ｈ 和失水后的硅氧烷形
ＬＬＣ 逐 渐被 键合相色谱 取代的根本原 因。在 近
代液相色谱发展的初期，常和气相色谱一样把有限 的几种固定液，例如 － 氧二丙腈、聚乙二醇、三 甲撑乙二醇和角鲨烷等涂渍在担体表面上，用一种 性质相差很大的溶剂冲洗， ＬＬＣ分离。 做 由于实际 上两种完全互不相溶的溶剂体系几乎不存在，因而 在Ｌ ＬＣ中固 定液相的流失就十分严重。为了克服 这个缺点，曾采取溶剂预先用固定液饱和及柱前增 加预饱和柱的方法，但这样做既不方便，柱系统的 稳定性也差。不可抽提的化学键合相的出现使这个 弊病得到克服，柱寿命大大延长，并且扩大了可用
表 ６ １ － Ｌ操作模式的使用调查 Ｃ
式饱和，这种硅醇基是进行键合的活性 官 能 团。 Ｓ ｙｅ认为硅胶表面可能有五种形式： ｎｄｒ
对表面键合反应有利的是１５ ，两种。实验表明，硅胶 在２０ 以前烘干仅能失去物理吸附水；０ ６０ ０ ２０ ０ 之间， 结合水（ 即羟基） 逐步脱除而出现硅氧烷结构，
但硅胶骨架不变化；０ 以上骨架开始变化。 ６０ 按照
晶体点阵计算， 硅胶表面羟基数目 ８ ｎ ２但用 是 个／ ， 化学方法测定的羟基数一般认为是～ ５ ｎ ２ 个／ｍ 。硅 胶表面上存在着足够的可反应硅醇基，再加上硅胶 本身的许多特点，例如强度好，孔结构和表面积易 于人为控制，有较好的化学稳定性等，因而是各种 化学键合相的理想基质材料〔 ２ 化学键合相在高效液相色谱中的应用，可以认 为引起了一场革命性的变化，使得在这以前的吸附 剂和担体上涂渍有机液相的液固吸附和液液分配为 主要操作模式的柱液相色谱大量地被键合相色谱所