菌种扩大培养

种子的质量要求：
• • • • 一定的浓度 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH，酶活等 无污染
2.3 种子扩大培养举例
例一、谷氨酸生产的种子制备
斜面菌种
→一级种子培养
→二级种子培养
→发酵
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；
诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开
发的进程。
从自然界中分离菌种的一般过程
采样 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择 → 产品的鉴定
选择育种方法时综合考虑的因素
(1) 待改良性状的本质及与发酵工艺的关系
生理状况稳定，个体与群体
活力强，移种至发酵后，能够迅速生长
无杂菌污染
种子扩培的两个阶段
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等 实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室 完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。 培养基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长 减少传代次数 孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发 酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。 培养基：控制成本，驯化；营养比发酵培养基丰富。
接种量的确定 移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为 7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。 倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。
发酵级数的确定
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第 一级种子罐开始计算发酵级数 确定依据： 发酵规模、菌体生长特性、接种量 级数大，难控制、易染菌、易变异，难管理，一般2-4级 谷氨酸的三级发酵：
可重复使用的多孔材 料，严格控制营养条 件，结束后挤压培养 液抽提产物 将营养生长期与生产 期分开，分别控制不 同条件 兼具固体培养法与液体 可培养霉菌、 培养法的优点 酵母、放线菌 等 工艺可达到最优 过程繁琐 氨基酸生产
两步法 液体深 层培养
2.2 影响种子质量的因素
• • • • • • • • 培养基 秧龄与接种量 温度 pH值 通气与搅拌 泡沫 染菌的控制 种子罐级数
冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水
特点： • 冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力 • 冻干后的菌株可常温保存，便于运输 • 必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等
在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞
2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；
一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素的三级发酵： 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
小节：
常见工业微生物的种类和用途 生产菌种的来源与保护 控制种子质量的基本方法和手段
问题：
在生产过程中如何控制种子质量？
End
Thanks!
氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌 其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
食品工业微生物
包括：酿造业，酶制剂等
食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期， 4-6期合成青霉素的能力最强
种龄
种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐 或发酵罐时的培养时间。
种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。 原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较 大，但是最终由实验结果定。
工业微生物的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成
产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强 遗传性能要相对稳定
不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关） 生产特性要符合工艺要求
工业微生物菌种保藏技术
第一章 菌种与种子扩大培养
1 微生物工业用菌 2 种子扩大培养
2.1 工业微生物的培养方法 2.2 影响种子质量的因素 2.3 种子扩培的实例
1 工业微生物
• 菌种的来源 自然界中有目的微生物分离的原则 菌种选育、分子育种 工业微生物的要求 常用工业微生物 菌种保藏
• • •
菌种来源
从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。 培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
2.1 工业微生物培养方法
静置培养法：嫌气发酵，如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等 固体 深层 通气培养法 液体 固体 液体
浅层
工业微生物常见培养方法及其特点
解释 固体培 养 即曲法培养，源于传 统制曲技术 特点 酶活力高 可调温湿度 适用范围 酿造业
液体深 层培养
载体培 养
液体培养，深层通风 可调节各种环境因素： 几乎所有好气 营养物浓度，温湿度等； 发酵：如有机 无菌操作要求高 酸、氨基酸等
(1) 低温冷冻保藏； (2) 转接培养或斜面传代保藏；
(3) 矿物油保藏；
(4) 土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。 保藏原理：创造休眠环境 保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便
保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化
冷冻保藏：-20℃以下冷冻，使微生物代谢活动停止
分类：普通冷冻保藏(-20℃) 超低温冷冻保藏(-60一-80℃) 液氮冷冻保藏 冻干保藏 特点：简单有效 培养物运输较困难
3. 二级种子(种子罐) 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列
PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。 大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体 4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱
超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。一些
• 传代保藏：斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月 • 载体保藏：麦壳，砂土灭菌后可用作载体
• 矿物油保藏：将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于
防止菌种衰退
• • • •
衰退的表现：生长，代谢（产品） 衰退的原因：保藏不妥，不利环境，回复突变等 防止衰退的方法：合理培养条件，减少传代次数 复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件
活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备
安培管
→ 斜面孢子 → 大米孢子
→ 二级种子 → 发酵
→ 一级种子来自百度文库
一、斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等
培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
二、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养条件：25℃、7天，控制湿度
2 种子扩大培养
种子：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产 菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐 级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯 种培养物称为种子。
种子扩培的目的
接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求
(2) 对这一特定菌种的遗传生化的认识程度 (3) 经济费用
• 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机
• 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择
一些常用工业微生物
抗生素生产有关的微生物
放线菌（链霉素四 环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源