肺炎支原体的耐药性

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分子诊断时代
分子生物学技术: 免疫学检测: 培养鉴定: 体外培养 Real Time PCR
ELISA
PA
LAMP
SAT
20世纪80至90年代
19世纪中叶
20世纪60年代
灵敏度低 n 检测周期长 n 成本低
n
成本低 n 无法解决“窗口期” 问题
n
特异、敏感、快速 n 仪器、人员、实验室有要求
n
MPP实验室诊断技术比较及其临床诊断价值

目前对该两种抗生素耐药的菌株已在体外诱导成功,在目标位置有 点突变。因此,临床耐药株出现的风险,尤其是喹诺酮类,是临床不合 理用药可能会导致的风险。
耐药肺炎支原体控制策略
改良实验室诊断
合理应用 抗生素
监测抗生素 耐药性
中医中药 中西医结合
Байду номын сангаас
建立快速病原 诊断方法
抗菌药物作用靶位
关于MP肺炎的诊断
体内诱导耐药株
体内诱导耐药株

大环内酯抗生素耐药株的出现与流行与临床上抗生素的广泛使用密切相 关,有研究显示,患者在接受抗生素治疗过程中发生了耐药突变。2013 年,日本报道两例患者在阿奇霉素治疗过程中发生耐药突变,分别为23S rRNA Ⅴ区耐药相关位点2063位A→G和2064位A→G,体外药敏实验显 示,阿奇霉素MIC显著升高。
如何准确快速检测临床样本中是否存在耐药菌和敏感菌的混合感染?同时
鉴定出敏感菌和耐药菌的比例? 针对上述问题,研究建立了一种准确快速诊断MP感染和耐药基因型,并进 一步鉴定样本中敏感菌和耐药菌比例的新方法:即等位基因特异扩增实时 定量PCR(Allele-specific real-time PCR(ASPCR))的建立
2012、2015年Cochran等荟萃分析儿 童MP下呼吸道感染的抗菌药物疗 效。纳人研究的MP感染者实验室诊 断缺乏统一标准。 有的文献提示使用大环内酯类抗菌药 物与非大环内酯类抗菌药物临床疗效 比较差异无统计学意义。
中西医结合治疗轻症MPP的研究结果
中西医结合治疗肺炎MP感染临床多中心试验研究
流行病学
2.肺炎支原体感染人群特点
人群
肺炎支原体感染多呈自限性的特点,其致病性与机体的 免疫特点相关,儿童和青少年免疫系统发育尚未成熟, 为其易感人群,且易引起临床症状,尤其是学龄前儿 童,为肺炎支原体感染的主要人群。
流行病学
3.肺炎支原体流行型别特点
流行型
肺炎支原体表面蛋白P1为其致病的主要部分,对基于P1 蛋白的分型是目前肺炎支原体分型的主要方式,根据P1 蛋白编码基因MPN141序列特点,采用比较脉冲场凝胶 电泳是经典的分型方法,将肺炎支原体分为两型,I型和 II型,目前主要的流行型别为II型。 小范围内的流行呈现同一型别流行的现象,提示同一区 域的肺炎支原体流行可能是来源于同一菌株。 各国的流行的具体型别各有不同,但未有研究表明型别 与致病性相关。 目前研究提示,大环内酯类抗生素耐药与型别并无直接 相关性
2007-2008 年广东40%
MP耐药监测数据的回顾及思考
不同年代、不同国家、不同地区、不同人群、不同检测 方法的耐药率是有差异的。(真与假),治疗方案要调 整。
MP耐药监测数据的回顾及思考
耐药的最新研究:等位基因特异扩增实时定量PCR方法建立及数据
针对大环内酯类抗生素耐药严重的现状,传统耐药检测手段已不能满足临 床需求。
快。
• PCR+基因测序:针对23SrRNA基因扩增+测序,标准基因序列比对; 单链构象多态性分析:巢式PCR产物+毛细管电泳-单链构象多态性检测,与标准株图形比较; 高分辨率溶解曲线分析:23SrRNA V区域所有已知与耐药相关的突变位点区域进行扩增,根据高分辨 率溶解曲线形态判断突变类型; 分子开关:应用敏感性分子开关(高保真DNA聚合酶和3’硫化修饰引物的分子开关),通过琼脂糖凝胶上 的条带或直接观察荧光信号检测MP对大环内酯类药物的耐药性(高或低);, AS-PCR:最新研究MP耐药检测方法-等位基因特异扩增实时定量PCR方法(AS-PCR),可以同时检测样本 中存在的敏感菌和耐药菌,并进一步确定其比例,为临床治疗提供参考和依据。
耐药的检测:等位基因特异扩增实时定量PCR方法建立

检测耐药基因位点,发现临床样本可以中同时存在
2063A和2063G位点;也就是说在一份临床样本中同时
存在敏感菌和耐药菌的混合感染。在检测的178份临床 咽拭子标本中,ASPCR检测的总阳性率为92.1% (164/178) 敏感菌14例,占8.5%;耐药菌36例,占 21%;耐药敏 感混合114例,占69.5%。 也就是说:敏感菌存在128/164,占78%;耐药菌 150/164,占91.4%。这提示我们,在临床治疗MP感染的病 人时,需要注意敏感菌和耐药菌的混合感染。
肺炎支原体的耐药性
辛德莉 首都医科大学附属北京友谊医院 2018年4月12日
目录
CONTENT
1
3 5
流行病学分析
2
3
肺炎支原体耐药现状
大环内酯抗生素耐药机制 肺炎支原体耐药与临床
体内诱导耐药株
流行病学分析
1.肺炎支原体年度流行特点
年度
肺炎支原体为呼吸道传播性疾病,有地区性流行的特点, 每4-5年流行一次,每次约持续18个月,秋冬季多发,但 有研究显示,流行特点与该地区的气候等因素相关,不 同地区间有所差异。 自2005年的一次暴发流行后,约2011年开始,又出现 了一次新的流行,多个国家监测到这次流行情况并进行 了相关报道,主要为北欧、美国、东亚、中东部分地区
50S大亚基 23S
rRNA结构域Ⅱ区;
核糖体蛋白L4、
L22 ;
肺炎支原体耐药主要检测手段
分离培养+药敏实验:实验的周期长,分离培养阳性率不高,不适用临床诊断。
快速培养+药敏(一体化)试剂盒 • 传统分离培养+药敏;
分子药敏:PCR扩增大环内酯类抗生素耐药相关靶位基因,不同方式检测其耐药性,近年来发展较
分离培养 血清学检测 分子生物学检测
荧光定量PCR 主要方 传统培养法 ELISA、微量颗 恒温扩增LAMP 法 快速培养法? 粒凝集(PA) SAT-RNA实时荧 光恒温核酸扩增检 测技术 特点 可靠
培养周期长, 用 于回顾性诊断 和研究
操作简单
双份是金指标,回 顾性诊断,单份对 诊断有帮助,早期 意义不
100.00%
2014-2016年北京市肺炎支原体耐药监测情况
84.30% 84.30% 71.42% 71.42% 84.60% 84.60%
80.00%
60.00% 40.00% 20.00% 0.00% 2014 红霉素
2015 阿奇霉素 四环素 左氧氟沙星
2016
大环内酯类耐药机制
50S大亚基 23S rRNA 结构域V区;
出现晚肺部听诊呼吸 音粗或可闻及干、湿 性啰音
病原学检测
v 培养鉴定法
v 血清特异性抗体检测

传统检测方法:PA试验 CF试验,无法区分IgM 和IgG; EIA或IF:可以特异性检测IgM 和IgG;
v 基于核酸技术的检测MP的分子生物学诊断方法
MP实验室诊断技术介绍
体外诊断行业发展过程和趋势
流行病学
MPP的流行病学变化
趋势1:社区获得性肺炎的重要病原菌,发病率有上升趋势;
趋势2;发病年龄低龄化(学龄前儿童、婴幼儿发病增多)
趋势3:难治性/重症病例增多
趋势4:出现耐药,中国耐药率高;
全球范围内MP耐药情况
2010-2012 加拿大12.1% 2010-2014 美国8.2~13.2%
84.30%
68.90%
71.42%
0.2 0.1 0
2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016
日本MP耐药数据变化情况
可以看出,耐药MP在日本出现的时间报道比较早,呈上升趋势
0.9 0.8
0.82 0.69 0.56 0.71 0.63
耐药的最新研究:等位基因特异扩增实时定量PCR方法建立及数据
ASPCR检测出MP的阳性率92.1%(164/178)。 其中:野生敏感型14份(8.5%),单纯A2063G突变型36份 (21%),耐药和敏感的混合基因型114份(69.5%)
ASPCR检测结果

野生敏感型
单纯突变型
耐药和敏感混合
特异、敏感、快速
早期诊断,需合格实 验室、仪器和人员, 有限制
临床价 值评估
肺炎支原体感染实验室诊断面临的问题
问题:1、对于临床确诊诊断,单份血清临床意义?
2、DNA、RNA以及培养的临床价值?
肺炎支原体肺炎的治疗现状
普通MPP
MP感染具有自限性,应用抗生素可以缩短病程,减轻病情,首选大环 内酯类抗生素。(?)
2010-2015英 国0-9.3% 2010-2011 丹麦1.6%
2010-2012 88.1%~100%
2011-2012日本 87.1%~89.2%
2007-2011 法国3.4~8.3% 2003-2012 德国1.2~3.6%
2010以色列 22%~30%
2008-2012 澳大利亚3.3%
耐药的最新研究:等位基因特异扩增实时定量PCR方法建立及数据
检测耐药基因位点,发现临床样本可以中同 时存在2063A和2063G位点;
敏感菌14例,占8.5%;耐药菌36例,占
21%;耐药敏感混合114例,占69.5%。 也就是说: 敏感菌存在128/164,占78%;耐药菌存在 150/164,占91.4%。 这提示我们,在临床治疗MP感染的病人时,需 要注意敏感菌和耐药菌的混合感染
2010意大利26%
文献报道国内部分地区MP耐药数据
上海耐药率 北京市耐药率 北京市耐药率(儿童成人)
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
0.3
80%
76.50%
69.20% 59.40%
98.40%
92.30%
92%
95.40% 84.40%
97.00%
92% 84.60%
90.00%
综合以下特点进 行经验性判断 流行病学特点 临床症状 体征 辅助检查 治疗反应
临床诊断 确定诊断
病原学检查:血清检测MP抗 体、MP核酸以及MP分离培 养。 X线 摄片 病原 检查 肺部 体征
症状
较肺部体征显著,可肺门阴影 增重、支气管肺炎、间质性肺 炎、均一肺实变、肺不张等。
发热(热型不定或无),咳嗽 (持续剧烈咳嗽为主,无痰或少 痰),少伴呼吸困难、喘憋等
难治性或重症MPP
关于抗生素:耐大环内酯类抗生素者,考虑转换疗法或其他抗生素,
如:米诺环素、喹诺酮类;混合感染,针对病原,联合使用抗生素;
合理规范使用激素;丙种球蛋白; 适时应用纤支镜。
抗生素治疗MPP存在的问题和争议
国外索引收录文献分析:2005年
Gavranich等,2010年Mulhollan等,
野生敏感型
ASPCR检测结果
单纯突变型
耐药和敏感混合
国内文献报道的MP耐药监测数据
2014年贵 州27.63% 2013年河 南33% 2015年河 北90% 2003-2006 年北京92% 2008年北 京91% 2011年北 京84.4%
大环内酯类抗生素耐药现状? 各地区耐药率差异的产生与哪些因素有 关?
PCR阳性患儿临床观察情况比较(治疗后)
组 别 中 西 医 组 西 医 组 t P n 体温开 始下降 时间 4.61±1 .46 退热时 间 咳嗽开始减 轻时间 咳嗽 消失 时间 8.06 ±2.1 6 9.83 ±2.6 0 2.190 0.036 痰减 少时 间 4.07± 1.27 痰消 失时 间 6.23± 2.0 啰音 减少 时间 3.63 ±1.3 3.85 ±1.6 3 -0.161 0.872 啰音 消失 时间 5.89± 1.83
2010-2011
湖南47.1%
2010-2012 北京71.7% 2015年无锡 88.2%pm 2005-2008 上海81.4% 2009-2011 上海87.5%
数据的可靠性如何? 检测技术和方法对结果是否产生了影响?
2012-2014
湖南邵阳92%盒 m
2005-2010 温州58.5%
2010年广 东54.5%
0.7
0.6 0.5 0.4
0.3
0.3
0.2 0.1 0
首 例
0
2000
2006
2008
2009
2010
2011
2012
近年来北京市支原体耐药监测情况
• 自2012年开始,为贯彻落实《抗菌药物临床应用指导原则》,牵头组织了
北京市支原体耐药监测的工作,北京市肺炎支原体对大环内酯类的耐药率依 然保持在较高水平,尚未发现对四环素类和喹诺酮类抗生素耐药的MP菌 株。
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