微生物来源的昆虫几丁质酶抑制剂的筛选与分离纯化

element analyses, and its nature also proved a multiple hydroxyl compound.
Key words：chitinase；inhibitor；screening；isolation
中图分类号： Q939.97
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2010)23-0271-05
1.1.4 仪器与设备 1515 型高效液相色谱仪、质谱仪 Waters 公司；
傅里叶红外光谱仪 Thermo Nicolet 公司；WFZ800-D38 紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；KDC-160H 高速冷冻离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司； HH 数显恒温水浴锅 江苏金坛市晶玻实验仪器厂；SPX150B 生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂； EURO EA 3000 元素分析仪 Leeman 公司。 1.2 方法
1.2.4 活性菌株的液体培养方法 活化后的菌株接种于液体培养基，细菌 37℃振荡培
养 2d，放线菌 30℃振荡培养 5d，培养液 6000r/min 离 心 1 0 min ，取上清。
1.2.5 平板透明圈法 把酶液与筛选待测液按 1:2 的比例混合，在几丁质
酶抑制化合物筛选平板上打孔[16]，取混合液 30μL 加样 于孔 中 ， 观 察 平 板 透 明 圈 的 大 小 。 在 检 测 过 程 中 以 缓冲液系统作为阴性对照、缓冲液酶液系统作为阳性 对照。
几丁质酶广泛存在于各种微生物、动物和植物中， 尤其在真菌和昆虫等的生长、繁殖和发育过程中起着重 要作用[1 ]。几丁质酶降解几丁质，转化、产生菌体蛋 白和氨基寡糖素等产物，在食品、医药、化妆及动物 饲料等行业广泛应用[2]。在昆虫体内，几丁质酶在其胚 后发育中扮演关键角色，尤其在幼虫蜕皮和化蛾阶段； 另外几丁质酶还涉及扩大和降低中央肠围食膜基质，保 护中央肠上皮组织[3]。由于昆虫的生长和发育严格地依 靠其改变自身几丁质结构的能力，昆虫以高度控制的方 式重复合成和降解几丁质以达到允许蜕皮和围食膜的再 生[4-5]，因此阻断在几丁质降解中的关键酶——几丁质酶 是理想的新型生物农药筛选模型。通过阻断几丁质酶，
时，收集蛹于 0.1mol/L、pH6.0 磷酸缓冲液中均质，冰 水浴中超声1s，间歇2s，150W 破碎 16min，4℃、10000r/min 离心 30min 收集上清[14]。
1.2.3 酶活力测定 以 N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖的生成速度测定酶活性大
小。50℃，以 N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖为标准，每小时 产生 1μmol/L N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖所需的酶量为一个 酶活力单位(U)[15]。
This bioactive material exhibited a single HPLC peak with a retention time of 15 min. Its inhibition rate on chitinase was
evaluated by DNS colorimetric method to be 54.2%. Moreover, its formula was C9H18O10 according to the IR and mass and
Abstract ：Helicoverpa armigera chitinase was used as the target to screen strains able to inhibit chitinase by transparent ring
plate screening method and DNS colorimetric screening method. A total of 29 strains including strain A0901# were selected out
行酶促反应 1h 后进行测定。
对照组 2 ：500μL 胶体几丁质加入 500μL 酶液、
来自百度文库
1000μL 培养液和 500μL pH6.0 磷酸缓冲液，加样后立
即沸水浴 10min 灭酶活，和其他组一起测定。
测试组 1 与对照组 1 的吸光度差值为ΔA1，测试组
2 与对照组 2 的吸光度差值为ΔA2，测定后按公式(1)计
※生物工程
食品科学
2010, Vol. 31, No. 23 271
微生物来源的昆虫几丁质酶抑制剂的筛选 与分离纯化
张洪斌，刘明艳，田玉敬，胡雪芹
(合肥工业大学化工学院，安徽 合肥 230009)
摘 要：通过对筛选条件进行优化，建立可靠的平板透明圈初筛方法和 DNS 比色复筛方法；以棉铃虫几丁质酶 作为筛选靶标并用此筛选模型对 500 多株菌株进行筛选，筛选出包括 A0901# 菌株在内的具有几丁质酶抑制作用的活 性菌株 29 株。采用活性追踪的方法对 A0901# 菌株发酵产物进行分离纯化，通过乙醇沉淀、Sevag 试剂除蛋白及 Sephadex G-100 凝胶色谱得到一个纯的活性物质，经 HPLC 检测显示在保留时间 15min 左右为一单峰，DNS 比色法 验证其抑制率为 54.2%，红外、质谱、元素分析表明此物质的分子式为 C9H18O10，并证明其为一个多羟基的化合 物。 关键词：几丁质酶；抑制剂；筛选；分离
对照组 1 ：500μL 胶体几丁质加入 500μL 酶液和 1500μL pH6.0 磷酸缓冲液，加样后立即沸水浴 10min 灭 酶活，和其他组一起测定。
测试组 2 ：500μL 胶体几丁质加入 500μL 酶液、
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食品科学
2010, Vol. 31, No. 23 273
1000μL 培养液和 500μL pH6.0 磷酸缓冲液，在 50℃进
由于几丁质酶抑制剂独特的作用机制，人们利用几 丁质酶抑制剂进行病虫害防治、医药生产、饲料加工 的研究已越来越受到重视。本研究直接从棉铃虫蛹中提 取酶，建立以平板透明圈初筛法和 DNS 比色法为复筛 的筛选方法，从我国丰富的微生物资源中获得几丁质酶 抑制化合物的生产菌株，并对其中的活性物质进行初步 的分离，以期从中发现对几丁质酶具有良好抑制作用的 化合物，为开发具有新型作用点的杀虫抗真菌药物提供 参考。
Screening and Purification of Insect Chitinase Inhibitor of Microbial Origin
ZHANG Hong-bin，LIU Ming-yan，TIAN Yu-jing，HU Xue-qin (School of Chemical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)
食品科学
※生物工程
了深入研究，这个阶段以阿洛菌素的发现和对其生物合 成机制的探讨为标志；第二阶段是对几丁质酶抑制剂与 几丁质酶之间相互作用进行的结构学研究，这为人工设 计几丁质酶抑制剂奠定了坚实的基础，这个阶段对精氨 芬、阿尔加定与几丁质酶相互作用方式和空间结构的阐 明为标志；目前，该领域的研究已经从筛选新的几丁质 酶抑制剂发展到建立新的筛选模型和发现已知几丁质酶 抑制剂的新功能[7]。到目前为止，已报道的几丁质酶抑 制剂有阿洛菌素(allosamidin)[8]、酪氨酸衍生物类、生 物碱类、环二肽( C I - 4 ) 、精氨芬( a r g i f i n ) [9 ]、阿尔加定 (argadin)[10]、甲基黄嘌呤药物及其衍生物、核黄素和黄 素衍生物等[11]。抑制剂的来源存在于微生物、植物中， 如 1983 年从非洲医用植物蓝茉莉(Plumbago capensis) 中 提取出的 plumbagin (2- 甲基 -5- 羟基 -1,4- 萘醌)能抑制 4 种农业鳞翅目昆虫的蜕皮[12]。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 材料与试剂 棉铃虫购于湖北省农业科学院；菌种均由本实验室
筛选保存；Sephadex G-100 为 Pharmacia 公司产品；其 他常用试剂均为分析纯。
1.1.2 培养基 NA 培养基(培养细菌)和高氏一号培养基(培养放
线菌) 。
1.1.3 几丁质抑制化合物的筛选平板 1% 胶体几丁质 8g，琼脂粉 1.5～2g，水 100mL，pH7.0。
of 500 ones. For separation and purification, the fermentation products of strain A0901# were subjected to alcohol precipitation, protein removal by Sevag, s method and gel filtration chromatographic fractionation, and a pure bioactive material was obtained.
1.2.1 胶体几丁质的配置 称取 2g 几丁质，加入 20mL 85g/100mL 质量浓度的
浓磷酸溶解，常温下放置 2 d 后，加蒸馏水稀释，反 复冲洗(采用离心分离)至 pH5.0 以上。离心后的几丁质 沉淀用蒸馏水调整终质量浓度至 1g/100mL[13]。
1.2.2 粗酶液的提取 将棉铃虫蛹于 25℃培养箱培养 8～10d 至快要化蛾
胶体几丁质＋几丁质酶→ N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖 在装有预热至45℃的0.5mL 1g/100mL胶体几丁质和 0.5mL 0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)比色管中，加入 0.5mL 酶液，于 50℃温育 1h，沸水浴保持 10min 中止反应， 将沸水浴后的酶液置于冰浴冷却，冷却后加入 1.5mL DNS 试剂，沸水浴 20min，冷却至室温后用蒸馏水定容 到 25mL，摇匀，离心后取上清，以灭活的等量酶液做 空白对照，在波长 50 0n m 处测吸光度，折算成酶活。
1.2.6 DNS 比色法 在酶反应体系中加入待测液，测定剩余酶活，以
灭活后的体系和原酶反应体系作为对照，根据酶活是否 下降以及下降的程度来判定抑制性。几丁质酶抑制物的 抑制活性可以用抑制率来计算：
测试组 1：500μL 胶体几丁质加入 500μL 酶液和 1500μL pH 6 . 0 磷 酸 缓 冲 液 ，在 5 0 ℃ 进 行 酶 促 反 应 1 h 后进行 测定。
收稿日期：2010-09-14 基金项目：安徽省国际科技合作项目(08080703017)；国家大学生创新性实验计划项目 (091035945) 作者简介：张洪斌(1 97 0 —)，男，副教授，博士，研究方向生物化工与酶工程。E-mail ：zh b5 67 8@1 63 .com
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阻止昆虫蜕皮、化蛾和围食膜的再生，以达到杀灭昆 虫的目的。而且由于几丁质不存在于脊椎动物中，因 而该类药剂对人畜较为安全，因此几丁质酶抑制剂可以 开发成为一种新型的绿色生物杀虫剂[6]，它对人畜安全 无毒，不污染环境，不破坏农作物的色香味，可应用 于作物生长的的任何时期，是食品安全的重要保证。
虽然近年来几丁质合成酶抑制剂如真菌多氧霉素都 已经上市，但是关于几丁质酶抑制剂的报道还很少。迄 今为止，世界上关于几丁质酶抑制化合物的相关研究大 致经历了 3 个发展阶段：第一阶段是从微生物代谢产物 中筛选作为昆虫生长调节剂和抗真菌剂的几丁质酶抑制 化合物，并就其对昆虫和真菌生命活动产生的影响进行
算抑制率。
抑 制 率 /% = —Δ—A1—－—Δ—A—2 ×100
(1)
ΔA1
1.2.7 活性物质的初步筛选 将发酵液抽滤取上清，加入 3 倍体积无水乙醇进行
醇沉处理，4℃冰箱过夜。醇沉过夜的发酵液在 6000r/min 离心 20min，沉淀用热蒸馏水溶解，加入 Sevag 试剂除 蛋白(加入比例为发酵液与 Sevag 试剂体积比 4:1；Sevag 试剂配比为氯仿与正丁醇体积比 4:1)。