高浓度葡萄糖对血管内皮细胞凋亡作用机制の研究

上海第二医科人学９９级硕十学何论文
高浓度葡萄糖对血管内皮细胞凋亡的作用及机制研究
中文摘要
血管并发症是糖尿病常见而危害严重的慢性并发症之一·偾料表明血管内皮细胞功能紊乱与糖尿病血管并发症密切相关，血管内皮细胞功能和内皮层结构的损害为血管病变的原发性因素。

近来研究提示高血糖可引起细胞内氧化应激的增加并导致细胞凋亡。

细胞凋亡可从多条途径和多个层面进行调控，若能阐明高血糖致血管内皮细胞凋亡的机理，则可进行早期干预，预防或延缓糖尿病血管并
．１厂一
发症的发生、发展。

为此夕我们在建立血管内皮绁盥溷亡摸型的基础上，对高浓度葡萄糖（２５ｍＭ）诱导的细胞凋亡及其干预药物进行了研究，并对它们的机制进行了探讨。

ｆ本研究采用人脐静脉血管内皮细胞株ＥＣＶ－３０４为研究对象，用２５ｍＭ葡萄｜
糖培养建立了高浓度葡萄糖条件下内皮细胞凋亡的模型，并进行定性定量鉴定。

我们用噻哗蓝（ＭＴＴ）法检测细胞活力，采用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡特异的阶梯状ＤＮＡ区带，并用流式细胞仪对凋亡进行定量检测。

结果发现：（１）ＥＣＶ－３０４细胞在２５ｍＭ葡萄糖条件下培养２４小时、４８小时、７２小时，ＭＴＴ法测得其ＯＤ值比『Ｆ常浓度葡萄糖（５．５ｍｍ）组分别下降２０．８６％０（Ｐ＜０．０５）、３１３３％、４５．２９％ｏ（Ｐ＜ｏ．０１）。

（２）用１．８％琼脂糖凝胶电泳可在高糖４８小时、７２小时组检测到细胞凋亡特异性ＤＮＡ片段。

（３）流式细胞仪检测到难常浓度葡萄糖组与高糖４８小时组细胞凋亡率分别为３．６％和１７．２％。

为进一步探讨高浓度葡萄糖导致内皮细胞凋亡的途径，我们检测了高糖（２５ｒａＭ）培养条件下凋亡内皮细胞内反应性氧自由基（ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳＤｅｃｉｅｓ；ＲＯＳ）、ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白、泛素（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ；Ｕｂ）ｍＲＮＡ的变化。

结果发现：（１）高糖培养４８小时组细胞内ＲＯＳ水平以每个细胞的平均通道荧光（ｍｅａｎｃｈａｎｎｅＩｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｅｒｃｅｌｌ；ＭＣＦ）计算为１４５．８４＋８．３５ＭＣＦ，较『Ｆ常浓度葡萄糖组（８２１９－＋４．０９ＭＣＦ）显著升高（ＪＤ＜Ｏ．０１）。

（２）凋亡执行蛋白ｃａｓｐａｓｅ．３在高糖４８小时组增加。

（３）ＵｂｍＲＮＡ在高糖２４小时、４８小时和７２小时组分别增加２５．３７
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％（Ｐ＜０．０５）、５３．４７％年１１６３．９３％（Ｐ＜Ｏ．０１）。

上述结果显示，高浓度葡萄糖诱导的ＥＣＶ一３０４细胞凋亡可能与高糖条件下细胞内ＲＯＳ、ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白和ＵｂｍＲＮＡ水平升高有关。

本研究进一步应用银杏叶提取物对高浓度葡萄糖条件下内皮细胞凋亡进行十预，观察细胞凋亡、细胞内ＲＯＳ、ｃａｓｐａｓｅ．３蛋白和ＬｉｂｍＲＮＡ的变化。

结果显示：（】）在高糖（２５ｍＭ）加银杏叶提取物（２５０９９／ｍ１）环境下培养４８小时，ＭＴＴ法测得ＥＣＶ－３０４细胞ＯＤ值比单纯高糖组升高４１．３０％（ＪＤ＜００５）；预先用银沓叶提取物（２５０９９／ｍ１）处理４８小时后换用高浓度葡萄糖（２５ｍＭ）加银杏叶提取物（２５０９９／ｍ１）继续培养４８小时，细胞ＯＤ值比未经银杏叶提取物（２５０Ｉ，ｔｇ／ｍ１）预处理组升高２１．３９％（｜Ｐ＜Ｏ．０５）。

（２）高糖加银杏叶提耿物后细胞内ＲＯＳ水平为１０３．６６＿＋５７４ＭＣＦ，较单纯高糖组（１４５．８４＋８．３５ＭＣＦ）显著下降（Ｐ＜０．０５）。

（３）高糖加银杏叶提取物后ＥＣＶ－３０４细胞凋亡率由１７．２％下降为８．７％。

（４）在高糖加银杏叶提取物组ｃａｓｐａｓｅ．３蛋白和ＵｂｍＲＮＡ较单纯高糖组水平升高。

结果提示，银杏叶提取物可能通过降低细胞内ＲＯＳ、ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白和ＵｂｍＲＮＡ水平而对抗高浓度熏扛萄糖引起的内皮细胞损伤。

我们的研究路果显示，高浓度葡萄糖可降低内皮细胞活力，诱导其凋亡，可能与ｃａｓｐａｓｅ一３和泛素介导的细胞浆内的蛋白水解系统有关，从蛋白降解这一方向研究高浓度葡萄糖导致血管内皮细胞损伤，可能对进一步阐明高糖条件下内皮细胞损伤的机理及寻找有关的防治药物有重要意义。

银杏叶提取物能对抗高浓度葡萄糖导致的细胞内反应性氧自由基的增加，提高内皮细胞在高糖环境下的活力，降低其凋亡率，对血篮由应缉盥起保护作用。

其机制可能与细胞浆内的蛋白降解途径有关，银杏叶提取物在蕴屡瘟血篮差发症的防治中有潜在的应用价值。

关键词：高糖；凋亡；氧自由墓银杏叶提取壤ｕＰＰ
Ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ
ｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
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ａｎｄｃａｌｌｂｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｆｒｏｍｍａｎｙｌｅｖｅｌｓｏｒｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｉｆｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｈｉｇｈ—ｇｌｕｃｏｓｅ—ｔｒｉｇｇｅｒｅｄａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｓｅｌｕｃｉｄａｔｅｄ，ｉｔｍａｙｂｅｐｏｓｓｉｂｌｅｔｏｉｎｔｅｒｖｅｎｅｔｈｅｈａｒｍｆｕｌｐｒｏｃｅｓｓｉｎｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅａｎｄｐｒｅｖｅｎｔｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｉａｂｅｔｅｓ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｍｏｄｅＩｏｆｈｉｇｈ—ｇｌｕｃｏｓｅ—ｔｒｉｇｇｅｒｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｔｈｅｎｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈｅｒｏｌｅｏｆｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｅｘｔｒａｃｔｏｆＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｖｏｌｖｅｄ．ＨｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｖｅｉｎｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅＥＣＶ－３０４ｗａｓｅｘｐｏｓｅｄｔｏｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｇｌｕｃｏｓｅ（２５ｍＭ）ｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｅｒｉｏｄｓ，Ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄ
ＭＴＴｔｅｓｔ，ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｆｏｒａｓｓａｙｉｎｇＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅｂｙ
ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｅｃｅｌｌｓｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙａＦＡＣＳｃａｎｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ．Ｗｅｆｏｕｎｄｔｈａｔ（１）ｔｈｅＯＤｖａｌｕｅｏｆＭＴＴｔｅｓｔｉｎＥＣＶ－３０４ｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎ２５ｒａＭｇｌｕｃｏｓｅｆｏｒ２４ｈ，４８ｈ，７２ｈｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙ２０．８６％（Ｐ＜Ｏ．０５）、３１．３３％、４５．２９％（Ｐ＜Ｏ．０１）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（２）ｔｈｅｔｙｐｉｃａｌｌａｄｄｅｒｐａｔｔｅｒｎｏｆＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｗａｓｆｏｕｎｄｉｎｔｈｏｓｅｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ２５ｒａＭｇｌｕｃｏｓｅｆｏｒ４８ｈｏｒ７２ｈｉｎＤＮＡｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｂｏｒｅｓｉｓ．（３）ＡｆｔｅｒｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｏｆＥＣＶ－３０４ｃｅｌｌｓｗｉｔｈ２５ｍＭｇｌｕｃｏｓｅｆｏｒ７２ｈｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓｗａｓ１７．２％ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄｉｔｗａｓ３．６％ｗｉｔｈ５．５ｍＭｇｌｕｃｏｓｅＴｏｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅ，ｗｅｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＲＯＳ，ｃａｓｐａｓｅ一３ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＵｂｍＲＮＡｉｎＥＣＶ－３０４ｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｏｒｈｉｇｈｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
２５ｍＭｇｌｕｃｏｓｅｆｏｒｏｆｇｌｕｃｏｓｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：（１）ＥｘｐｏｓｕｒｅｏｆＥＣＶ－３０４ｔｏ
４８ｈｔｈｅｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｔａｒＲＯＳｆｏｒｍａｔｉｏｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｎｈａｎｃｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔＯ５５ｍＭｇｌｕｃｏｓｅ（１４５．８４＋－．８．３５ＭＣＦＶＳ８２．１９±４．０９ＭＣＦ，Ｐ＜０．叭）．（２）ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆ
ＥＣｖ＿３０４ｔｏ２５ｍＭｇｌｕｃｏｓｅｆｏｒ７２ｈｃａｓｐａｓｅ一３ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｏｆ
（３）Ａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎ２５ｒａＭｇｌｕｃｏｓｅｆｏｒ２４ｈ，４８ｈａｎｄ７２ｈ，ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＵｂｉｑｕｉｔｉｎ
ｍＲＮＡｉｎＥＣＶ－３０４ｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ２５．３７％（Ｐ＜Ｏ．０５）、５３．４７％ａｎｄ６３９３％（Ｐ＜Ｏ．０１）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．ＴｈｅａｂｏｖｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＲＯＳｕｎｄｅｒｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｍａｙｉｎｄｕｃｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＥＣＶ－３０４ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｓｐａｓｅ一３ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＵｂｉｑｕｉｔｉｎｍＲＮＡｓｅｅｌｒＪｓｔｏｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄ
ＷｅｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈｅｒｏｌｅｏｆｅｘｔｒａｃｔｏｆＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａ（ＥＧｂ）ｉｎｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈ·－ｇｌｕｃｏｓｅ－—ｔｒｉｇｇｅｒｅｄｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：（１）ＩｎＭＴＴｔｅｓｔ，ｔｈｅＯＤｖａｌｕｅｏｆＥＣＶ－３０４ｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｗａｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ２５ｍＭｇｌｕｃｏｓｅｐｌｕｓ２５０ｐｇ／ｍｌＥＧｂｍｅｄｉｕｍ，ｉｎｃｒｅａｓｅｂｙ４１３０％ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ２５ｒａＭｇｌｕｃｏｓｅｇｒｏｕｐｗｉｔｈｏｕｔＥＧｂ（Ｐ＜０．０５）．ＥＣＶ－３０４ｃｅｌｌｓｗａｓｐｒｅ－ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ２５０９９／ｍｌＥＧｂｆｏｒ４８ｈｔｈｅｎｃｕｌｔｕｒｅｄｕｎｄｅｒ２５ｒａＭｇｌｕｃｏｓｅｐｌｕｓ２５０ｐ＿ｇ／ｍｌＥＧｂｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅＯＤｖａｌｕｅｏｆｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｂｙ２１．３９％ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｎｏｎ—ｐｒｅ－ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐ（Ｐ＜００５）．（２）ＴｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆＥＧｂ（２５０ｐ．ｇ／ｍ１）ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｈｉｇｈ—ｇｌｕｃｏｓｅ—ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＲＯＳｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｏｍ１４５．８４＿＋８．３５ＭＣＦｔｏ１０３．６６±５．７４ＭＣＥ（３）ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｃｅｌｌｓｉｎｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｐｌｕｓＥＧｂ（２５０／．ｔｇ／ｍ１）ｇｒｏｕｐｉｓ８７％，ｗｈｉｃｈｉｓｌｏｗｔｈａｎｉｎｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｇｒｏｕｐ（１７．２，∞．（４）Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｃａｓｐａｓｅ一３ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＵｂｍＲＮＡｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎ２５ｒａＭｇｌｕｃｏｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｗａｓａｔｔｅｎｕａｔｅｄｂｙｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆＥＧｂａｔａｄｏｓｅｏｆ２５０ｐ＿ｇ／ｍｌ
ＡｌｌｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｍｅｎｔｉｏｎｅｄａｂｏｖｅｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｍａｙｉｎｄｕｃｅＥＣＶ－３０４ｃｅｌｌｓａｐｏｐｔｏｓｉｓａｔｌｅａｓｔｐａｒｔｌｙｔｈｒｏｕｇｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＲＯＳ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｃａｓｐａｓｅ一３ｐｒｏｔｅｉｎ，ｕｂｉｑｕｉｔｉｎｓｅｅｍｅｄｔｏｉｎｖｏｌｖｅｄａｌｓｏ．ＥＧｂ
ｃａｎａｔｔｅｎｕａｔｅｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓａｔｌｅａｓｔｐａｒｔｌｙｔｈｒｏｕｇｈｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＲＯＳｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｃａｓｐａｓｅ一３ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＵｂｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＥＧｂｍａｙｅｘｅｒｔａｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｅｆｆｅｃｔｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｖａｓｃｕｌａｒｄｉｓｅａｓｅ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ；ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ＲＯＳ；ＥＧＢ；ＵＰｐ
—～圭塑篁三堕型叁堂！！堡堡±堂垡堡塞
图１．１ＥＣＶ－３０４细胞形态
２、ＭＴＴ棱检测ＥＣＶ－３０４细胞活力改变
Ｅｃｖ－３０４细胞在『Ｆ常浓度葡萄糖（５．５ｍＭ）下生长至呈８０％融合，换用含Ｏ·２％牛血清白蛋白的高浓度葡萄糖（２５ｍＭ）和萨常浓度葡萄糖的ＤＭＥＭ培养液，分别培养２４小时、４８小时、７２小时，ＭＴＴ法检测细胞活力。

如图１２所不，高糖条件下ＥＣＶ－３０４细胞在２４小时、４８小时、７２小时ＯＤ值比ｆ常浓度葡萄糖组分别下降２０．８６％（ＪＤ＜０．０５）、３１．３３％、４５．２９％（尸＜０．０１），说明高浓度葡萄糖可显著降低ＥＣＶ－３０４细胞活力。

图１．２不同时间高浓度葡萄糖（２５ｍＭ）对ＥＣＶ－３０４
细胞活力的影响
２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ分别代表相：正常浓度葡萄糖（５５ｍＭ）或ｌ角浓度葡萄
糖（２５ｒａＭ）条件下培养２４小时、４８小时、７２小时。

’Ｊ对照纠相比：
８Ｐ＜００５，＋Ｐ＜Ｏ０１．ｎ＝１２
３、琼脂糖凝胶电泳ＤＮＡｌａｄｄｅｒ分析
抽提高浓度葡萄糖（２５ｍＭ）培养２４小时、４８小时、７２小时及『Ｆ常浓度葡萄糖（５．５ｒａＭ）培养７２小时ＥＣＶ－３０４细胞的ＤＮＡ，在１．８％琼脂糖凝胶中进行电泳。

如图１３所示，高糖４８小时、７２小时组细胞ＤＮＡ形成凋亡细胞典型的阶梯状区带电泳图谱（ＤＮＡｌａｄｄｅｒ），正常浓度葡萄糖组及高糖２４小时组细胞ＤＮＡ仅在电泳加样孔附近出现基因组条带，无ＤＮＡｌａｄｄｅｒ出现。

图１．３ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳图
Ｍ：ｍａｒｋｅｒ；Ｉ：正常浓度葡萄糖（５，５ｒａＭ）组；２、
３、４分别代表商浓度葡萄糖（２５ｍＭ）培养２４小时
４８小时、７２小时。

—堂堑堕壁墅型塑
结果
１、细胞内反应性氧自由基水平分析
Ｅｃｖ．３０４细胞在含２５ｍＭ葡萄糖的培养基中培养４８小时，细胞内ＲＯＳ水平为１４５．８４＿＋８３５ＭＣＦ，较正常浓度葡萄糖组（８２．１９＿＋４．０９ＭＣＦ）显著升高（尸＜Ｏ０１）。

（图２１）
图２１高糖４９小时对细胞内ＲＯＳ的影响
ＮＧ：正常浓度葡萄糖（５５ｒａＭ）组；ＨＧ：高糖（２５ｒａＭ）组
与ＮＧ相比·Ｐ＜００１。

数据为４次试验的统计结果ｎ
２、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白变化
ＥＣＶ．３０４细胞分别在高糖（２５ｒａＭ）及正常浓度葡萄糖（５．５ｍＭ）下培养４８小时，用三去污细胞裂解液（参见试剂部分）抽提细胞蛋白质，经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，显示高糖组ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白水平明显高于对照组。

（图２２）
图２．２Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ分析高糖对
ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白的影响
ＮＧ：正常浓度葡萄糖（５５ｍＭ）组；ＨＧ：高
糖（２５ｒａＭ）组。

孵育时间４８小时
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３、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析ＵｂｍＲＮＡ的表达
１）抽提总ＲＮＡ的完整性分析
ＥＣＶ－３０４细胞在２５ｍＭ葡萄糖条件下分别培养２４小时、４８小时、７２小时及在『Ｆ常浓度葡萄糖（５．５ｍＭ）下培养７２小时，抽提各组细胞的总ＲＩｇＡ，经１％的琼脂糖凝胶变性电泳后可清楚的观察到２８Ｓ、１８Ｓ的存在，且２８Ｓ：１８Ｓ约等于２：ｌ，表明抽提的ＲＮＡ完整性较好，可进行ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ分析。

（图２．３）
图２．３琼脂糖凝胶电泳分析ＲＮＡ完整性
Ｉ：证常浓度葡萄糖（５５ｒａＭ）组；２、３、４分别代表
商糖（２５ｒａＭ）培养２４小时、４８小时、７２小时封上。

２）ＵｂｍＲＮＡ的Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析
证常浓度葡萄糖（５．５ｍＭ）培养７２小时、高浓度葡萄糖（５．５ｍＭ）培养２４小时、４８小时、７２小时的细胞总ＲＮＡ经Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析后，ｘ光片经扶度扫描并作统计分析。

如图２．２所示，２５ｍＭ葡萄糖培养细胞２４小时、４８小时、７２小时多聚ＵｂｉｑｕｉｔｉｎｍＲＮＡ较正常糖浓度培养组分别增加２５．３７（Ｐ＜０．０５）、５３．４７％和６３９３（Ｐ＜０．０１）。

图３．１ＥＣＶ－３０４细胞内ＲＯＳ生成变化
ＮＧ：葡萄糖５５ｍＭ；ＨＧ：葡萄糖２５ｍＭ；ＥＧＢ：
ＥＧＢ２５０¨ｇ／ｍｌ。

’ｊＮＧ相比＋Ｐ＜００ｌ：’ｊＨＧ相比印＜００５。

数据为４次试验的统计结果。

３、流式细胞仪分析各组细胞凋亡
ＥＣＶ一４０３分别在正常浓度葡萄糖（５．５ｒａＭ）、高糖（２５ｒａＭ）加银沓叶提取物（２５０“ｇ／ｍ１）和单纯高糖条件下培养４８小时，收集细胞用流式细胞仪定量检测细胞凋亡。

对照组细胞凋亡率为３．６％，单纯高糖４８小时组细胞凋亡率为１７．２％，高糖加银杏叶提取物后细胞凋亡率下降为８．７％。

说明银杏叶提取物在２５０１ｕｇ／ｍｌ浓度下可显著降低高浓度葡萄糖诱导的内皮细胞凋亡。

（图３３）
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４、Ｎｏｒｔｈｅｎｂｌｏｔ分析各组细胞ｕｂｍＲＮＡ表达变化
１）内皮细胞抽提ＲＮＡ完整性分析
ＥＣＶ－３０４细胞分别在正常葡萄糖（５．５ｍＭ）、高糖（２５ｍＭ）及高糖（２５ｒａＭ）加银含叶提取物（２５０ｐｇ／ｍ１）条件下培养４８小时，抽提细胞总ＲＮＡ，ｌ％琼脂糖凝胶变性电泳后可清楚的观察到２８Ｓ、１８Ｓ的存在，且２８Ｓ：１８Ｓ约等于２：１，表明抽提的ＲＮＡ完整性较好，可进行ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ分析。

（图３．４）
图３．４琼脂糖凝胶电泳分析ＲＮＡ完整性
ｌ：葡萄糖ｓ５ｒａＭ：２：葡萄糖２５ｍＭ培养４８小时
３：葡萄糖２５ｍＭ商ｆＥＧＢ２５０９９／ｍｌ培养４８小时。

２）ＵｂｍＲＮＡ的Ｎｏｒｔｈｅｎｂｌｏｔ分析
『Ｆ常葡萄糖（５．５ｍＭ）、高糖（２５ｍＭ）及高糖（２５ｍＭ）加银畲叶提取物（２５０ｐｇ／ｍ１）三组细胞的总ＲＮＡ经Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析，发现高糖组ＵｂｍＲＮＡ较Ｊ下常糖浓度组表达增加，高糖（２５ｍＭ）｝／／］银杏叶提取物（２５０９９／ｍ１）组ＵｂｍＲＮＡ较单用高糖组表达下降，银杏叶提取物在２５０ｔｓｇ／ｍｌ浓度下可下调高糖诱导的ｕｂｍＲＮＡ高表达。

（图３．５）
图３．５Ｎｏｒｔｈｅｎｂｌｏｔ分析ＵｂｍＲＮＡ表达
１：葡萄糖５５ｍＭ；２：葡萄糖２５ｍＭ培养４８小时
３：葡萄糖２５ｍＭ方¨ＥＯＢ２５０１．ｔｇ／ｍｌ培养４８小时。

３２
５、Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ分析各组细胞ｃａｓｐａｓｅ．３蛋白表达
ＥＣＶ－３０４细胞分别在正常葡萄糖（５．５ｍＭ）、高糖（２５ｍＭ）及高糖（２５ｍＭ）加银杏叶提取物（２５０肛ｇ／ｍ１）条件下培养４８小时，用三去污裂解缓冲液抽提各组细胞蛋白质，经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，可见高糖条件下ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达升高，银杏叶提取物可降低高糖状态下ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白的高表达。

（图３．６）
图３．６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白表达
１：葡萄糖５．５ｍＭ：２：葡萄糖２５ｍＭ培养４８小时
３：葡萄糖２５ｍＭ加ＥＧＢ２５０９９／ｍｌ培养４８小时。

讨论
银杏叶提取物的活性成分主要有银杏黄酮苷、银杏内酯和白果内酯等，研究表明银杏叶提取物可诱导多种哺乳动物细胞内Ｙ型谷胱甘肽合成酶（ＹＧＣＳ）ｍＲＮＡ上调，同时使细胞内ＧＣＳ蛋白和ＧＳＨ升。

还原型谷胱甘肽本身为有效的抗氧化剂和自由基清除剂，同时它也是线粒体中谷胱甘肽过氧化物酶的必须因子，这使得还原型谷胱甘肽成为线粒体中对抗有潜在威胁的过氧化氢的最有力防线，也是生物体内重要的抵抗氧化应激的还原性物质。

银杏叶提取物可能通过影响与调节体内氧化还原状态有关的酶系发挥其抗氧化作用，通过清除机体过多的自由基，抑制细胞膜的脂质发生过氧化反应，从而保护细胞膜，防止自由基对机体造成的一系列伤害。

鉴于银杏叶提取物的抗ＲＯＳ作用，我们对它在防治高糖导致的血管内皮细胞凋亡及机制进行了研究。

本实验用ＭＴＴ法测得高糖加银杏叶提取物培养４８小时后细胞ＯＤ值比单用高糖培养４８小时显著升高（尸＜Ｏ．０５），即银杏叶提取物可增加高糖条件’卜内皮
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结论
１、高浓度葡萄糖（２５ｍＭ）可降低内皮细胞活力，培养时间大于４８小时可明显
诱导血管内皮细胞凋亡。

２、高浓度葡萄糖（２５ｍＭ）可使细胞内反应性氧自由基水平明显升高，同时
ＵｂｉｑｕｉｔｉｎｍＲＮＡ及Ｃａｓｐａｓｅ一３蛋白显著上调。

３、银杏叶提取物预处理的细胞其活力较未处理组增高，银杏叶提取物可增加高糖条件下内皮细胞活力；银杏叶提取物可降低高糖条件下内皮细胞凋亡和细胞内反应性氧自由基水平，对高糖条件下Ｃａｓｐａｓｅ一３和ＵｂｍＲＮＡ的过度上调有缓解作用。

４、提示高糖可能通过增加细胞内反应性氧自由基水平最终激活ｃａｓｐａｓｅ．３途径而
诱导凋亡，泛素可能参与这一过程。

而银杏叶提取物因其抗氧化功能在糖尿病血
管并发症的防治中有潜在的应用价值。

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致谢
衷心感谢导师李果教授三年来对我学业上的悉心指导，生活上无微不至的关心。

他严谨的治学态度、渊博的知识和崇高的人格，将使我终生受益，也是我今后学习的楷模。

三年来，导师组罗敏教授在我的学习和科研工作上都给予了很多的支持和帮助，在此向他表示衷心的感谢。

感谢陈家伦、许曼音教授、陈名道教授、胡仁明教授等对我的指导和支持。

深深感谢李纪平、刘云老师三年来给予我生活、学习和工作上的帮助和支持。

感谢中西医结合研究室唐会凤、李风英老师的热心帮助和支持。

感谢徐焰、吴洪熙、赵福妹、稽雪兰、罗雪艳、张惠云、等老师在行政及后勤工作上对我的支持。

感谢刘优萍、伍贻新、张迪、谢晓燕、周文忠、陈战等人的热心支持和帮助。

感谢左祥生、骆天红、杨义生、张芳林、许光武、宋怀东、杨颖、殷俊、李荣英、周丽斌、王宣春、俞放、吴刚、章国玉、杨架林、贾秀娟、牟波、徐立勤、王绍云等同门手足的支持和帮助。

感谢我的同学宋巍、李敏、李光明、周敏等给予的大力帮助。

最后，向一直关心、鼓励我的家人致以衷心的感谢！
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综述
泛素－－２６ｓ蛋白酶体途径在凋亡中的作用
王晓综述李果审阅
上Ｎ第２Ｎ科大学附属瑞金医院，上海市内分泌研究所（上海，２０００２５）摘要：泛素一２６ｓ蛋白酶体途径（ｕＭｑｕｉｔｉｎ一２６ｓｐＦｏｔｅａｓｏｍｅｐａｔｈｗａｙ：ＵＰＰ）是真核生物细胞中ＡＴＰ依赖的蛋白降解系统，可通过选择性降解细胞凋亡相关的调节性蛋白，参与细胞凋亡的调控。

关键词：ＵＰＰ；蛋白降解；凋亡；细胞周期；转录调控
泛素一２６ｓ蛋白酶体途径（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ一２６ｓｐｒｏｔｅａｓｏｍｅｐａｔｈｗａｙ：ｕＰＰ）是细胞内ＡＴＰ依赖的非溶酶体蛋白降解机制‘”，可高效并高度选择性地降解细胞内蛋白质，尤其是短寿命的功能蛋白、癌基因产物如细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）、ｐ２１、ｐ２７、ＰＫＣ、ｗｔｐ５３、ｃ—Ｊｕｎ、ｃ．Ｆｏｓ及ｃ—Ｍｏｓ等，应激状态下也降解细胞内结构蛋白。

该蛋白水解通路的发现被认为是细胞周期、细胞恶性转化和免疫学研究的转折点。

研究表明该系统在凋亡调节中也发挥重要作用１２Ｊ。

１泛素一２６ｓ蛋白酶体途径简介
ＵＰＰ系统水解底物的第一步是将泛素（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ；Ｕｂ）标记到将被降解的靶蛋白上，即将Ｕｂ共价交联到靶蛋白的赖氨酸￡一氨基上，称为底物的Ｕｂ化；Ｌｉｂ化的底物可进一步被２６ｓ蛋白酶体识别并降解。

１．１Ｕｂ结合系统泛素是７６个氨基酸组成的多肽，分子量约８．５ｋＤ，其结构在真核生物细胞内高度保守。

目前发现参与Ｕｂ化反应的酶至少有Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３这３类：Ｅ１即Ｕｂ激活酶（Ｕｂａｃｔｉｖａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ），在ＡＴＰ参与下，Ｅ１以其活性位点半胱氨酸的毓基与Ｕｂ的Ｃ末端生成高能硫酯键，使Ｕｂ活化；Ｅ２即Ｕｂ转运蛋白或结合酶（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ—ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓ；Ｕｂｃｓ），是由多个成员组成的蛋白家族，可接受Ｅｌ传递来的Ｌｉｂ，在Ｅ３参与下将Ｕｂ转移到底物上；Ｅ３即Ｕｂ一蛋白质连接酶（Ｌｉｂ—ｐｒｏｔｅｉｎｌｉｇａｓｅ），这是一个更为复杂和庞大的家族，它们直接或间接与底物结合，促进Ｕｂ从与Ｅ２形成的硫酯中间产物转移到底物上，或转移到已与底物相连的Ｕｂ上形成Ｕｂ链，作为底物降解的靶向性信号。

许多Ｅ３
上海第二医科大学９９级硕十学位论文——————————————————————————————————————————————————————————————一一
家族成员往往与其他蛋白形成复杂的多亚单位复合体，再与特定的Ｅ２家族成员协同作用，对不同的底物进行特异性的识别，呈现出蛋白质降解的高度选择性。

根据结构和／或所识别降解信号的种类，已鉴定出４个Ｅ３亚型…。

即Ｅ３ｃｘ、ＨＥＣＴ结构域蛋白（Ｈｏｍ０１０９０ｔｌＳｔｏＥ６～ＡＰｃａｒｂｏｘｙ｜ｔｅｒｍｉｎｕｓ）、分裂后期促进复合物（ａｎａｐｈａｓｅｐｒｏｍｏｔｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘ；ＡＰＣ）和ＳＣＦ复合体，ＳＣＦ的名称来源于它的３个早期发现的成分：Ｓｋｐｌ、Ｃｄｃ５３／Ｃｕｌｌｉｎ和含Ｆ盒蛋白质ｐ１（Ｆ—ｂｏｘｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｆｂｐｓ）的～种，该复合体还包含最近发现的一种环指状蛋白Ｒｂｘｌ【４】。

不同的ＳＣＦ复合体中可含有不同的Ｆｂｐ，Ｆｂｐｓ作为底物识别因子，可识别特定位点磷酸化的底物。

底物的ｕｂ化成为其被２６ｓ蛋白酶体降解的靶向性信号。

１．２２６ｓ蛋白酶体系统２６ｓ蛋自酶体由２０ｓ核心催化颗粒和多种调节成分组成［５１。

２０ｓ蛋白酶体由０ＬＨ和Ｄｌ￣７共１４种亚单位组成，其中７个同源的仪亚单位和７个同源的ｐ亚单位分别组成０ｌ环和ｐ环，两个ｐ环在中『自Ｊ、两个＆环在两侧，４个环层叠成圆筒状的２０ｓ蛋白酶体，酶活性位点位于２０圆柱体空心结构中心，水解中一ＩＩ，由Ｂ环内３个残基Ｔ１１：ｒｌ、Ｌｙｓ３３、Ｇｌｕｌ７和Ｎ末端自由氨基组成。

另外，哺乳动物还有３个可被ＩＦＮ－－＇／诱导的Ｂ亚单位，可替代其组成性的同源亚单位，改变蛋白酶体的活性，在抗原加工和递呈中起重要作用。

目前己知的调节成分有１９ｓ帽（ｃａｐ）和ＰＡ２８，大肠杆菌中与２６ｓ蛋白酶体结构、功能相似的为ＨｓＩＶＵ（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｌｏｃｕｓＶＵ），已有学者成功的解析出其晶体结构［６】，这将大大促进对于真核生物２６ｓ蛋白酶体作用机制的研究。

Ｕｂ化的底物在２６ｓ蛋白酶体中被降解，Ｕｂ可被去Ｕｂ化酶（ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓ；ＤＵＢｓ）从底物水解下来，重复利用。

２ＵＰＰ在凋亡中的作用
对烟草幼鹰蛾体节间肌肉萎缩机制的研究，引发了ＵＰＰ在细胞凋亡中作用的探讨。

编码多聚Ｕｂ基因的ｃＤＮＡ与从萎缩肌肉中提取的ＲＮＡ杂交，发现多聚ＵｂｍＲＮＡ表达显著升高伴有Ｕｂ一蛋白结合物增加，这两项发现在组织切片中得到证实且发生在细胞凋亡的形态学改变之前【２】，一系列类似报道引起研究者对ＵＰＰ途径在凋亡调节中作用的兴趣。

随着蛋白酶体抑制剂特别是特异性抑制剂ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ的发现，大大方便了对ｕＰＰ和凋亡作更直接的研究，使得对于探讨ＵＰＰ在凋亡中的作用机制成为可能。

多聚（ＡＤＰ一核糖体）聚合酶ＰＡＲＰ是ＤＮＡ修复关键酶，凋亡时ＣＰＰ３２（即
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Ｃａｓｐａｓｅ３）可裂解ＰＡＲＰ。

在Ｕ９３７成单核细胞、ＨＬ６０细胞和ＲＶＣ细胞，蛋白酶体抑制剂可提高ＣＰＰ３２活性，加快ＰＡＲＰ降解，促进凋亡‘２１。

近年来的研究证明，线粒体跨膜电位△ｖｍ下降是细胞凋亡发生的重要环节。

地塞米松诱导凋亡的胸腺细胞，蛋白酶体抑制剂处理后可阻止△‰下降，同时阻止了线粒体后超氧化物阴离子生成、核ＤＮＡ丧失和磷脂酰丝氨酸暴露，从而抑制了凋亡。

由此可推测，蛋白酶体对凋亡的调控是发生在Ｃａｓｐａｓｅ级联反应和线粒体变化的上游事件【引。

Ｄ５３、ＮＦ．１（Ｂ和Ｂｃｌ一２家族中的Ｂｃｌ．２是重要的凋亡调控因子，而它们都是ＵＰＰ的底物‘７。

】，此外，Ｕ】）Ｐ还参与调控与凋亡密切相关的细胞周期、转录激活、信号传导等过程，因此ＵＰＰ对凋亡的调控可能是多途径的。

２．１Ｐ５３途径
Ｐ５３是促进细胞凋亡的重要调控因子，同时也是ＵＰＰ的底物，这使得Ｐ５３成为联系ＵＰＰ和凋亡的第一个候选因子。

ｐ５３在凋亡调控中的作用是肯定的也是复杂的，作为转录因子ｐ５３可通过转录激活一系列靶基因实现对凋亡的调控【】…，其中有些基因编码的蛋白参与线粒体膜完整性和通透性的控制，如Ｂｃｌ．２家族中的Ｂａｘ、Ｂｃｌ一２、Ｂｃｌ—ＸＬ，有些编码死亡受体，如ＦＡＳ、ＤＲ５、ＤｃＲｌ／ＴＲＩＤ、ＤｃＲ２ｔＴＲＵＮＤＤ，其它还有如ＰＩＧｓ、ｐ２１ｗＡ“ＩＰＩＧｌ４）、ＧＡＤＤ４５、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦ—ＩＩ、ＩＧＦ—ＩＲ、ＰＡＧ６０８、ｐ８５等。

２．１．１Ｂｃｌ一２家族这是一个与凋亡密切相关的蛋白家族，其中Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ．Ｘｓ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｈｒｋ和Ｂｏｋ有促凋亡活性，Ｂｃｌ．２、Ｂｃｌ。

ＸＬ、Ｂｃｌ．Ｗ、Ｍｃｌ．１、Ａ１／Ｂｆｌ一１有抑凋亡活性，促凋亡和抑凋亡活性的比例对凋亡的调控至关重要。

体外研究显示，Ｂａｘ：Ｂａｘ二聚体可形成穿越线粒体膜的通道，也可促进线粒体内膜渗透性膜孔的开放。

而Ｂｃｌ．２、Ｂｃｌ．Ｘ１可抑制这种现象。

ｐ５３可上调Ｂａｘ、下调Ｂｃｌ一２，推测ｐ５３可利用Ｂａｘ形成膜孔的能力调节线粒体跨膜电位，增加线粒体内细胞色素Ｃ、ＡＩＦ等的释放，促进凋亡。

２．１．２ＰＩＧｓ（ｐ５３一ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓ）ＰＩＧｓ包括１３种控制氧化还原的基因和ｐ２１，这些基因均在ｐ５３诱导的凋亡之前出现，可以设想应激导致ｐ５３水平升高，诱导ＰＩＧｓ表达，产生反应性氧自由基，导致线粒体膜损伤诱发凋亡。

ｐ２１是一个细胞周期抑制物，它在ｐ５３介导的细胞周期停滞中有重要作用，但对凋亡的直接影
上海第二医科大学９９级硕十学位论文响尚不清楚。

２．１３膜死亡受体途径ｐ５３可诱导ＦＡＳ、ＦＡＳＬ、ＤＲ５、Ｄｃｒｌ／ＴＲＩＤＤ、ＤｃＲ２／ＴＲＵＮＤＤ表达上调，可通过膜死亡受体途径诱导细胞凋亡ａＤ５３主要的细胞内调节物为癌基因蛋白ＭＤＭ２，它由野生型ｐ５３诱导产生，可与ｐ５３直接作用并抑制其活性，形成负反馈调节环路。

研究认为ＭＤＭ２具有泛素连接酶的作用…】，可促进ｐ５３蛋白从核内向胞浆转运，以其４２～９４位氨基酸在Ｄ５３蛋白Ｎ末端附近与ｐ５３结合，并以４６４位的半胱氨酸与Ｕｂ结合，催化Ｄ５３的Ｕｂ化，２６ｓ蛋白酶体可识别并降解Ｌｉｂ化的ｐ５３［他１，使ｐ５３保持在较低的水平，细胞正常生长。

ｕＰＰ可通过降解ｐ５３来调控细胞凋亡，应用蛋白酶体抑制剂后，在发生细胞凋亡的同时还检测到ｐ５３和Ｕｂ化ｐ５３的升高。

另外，某些凋亡诱导因素如氧化型低密度脂蛋白、ＮＯ等在诱导凋亡的同时，出现蛋白酶体活性下降‘”］、ｐ５３蛋白水平升高ｆ１４１，似乎这些因素本身起着蛋白酶体抑制剂的作用。

２２细胞周期途径
在整个细胞周期中判别和消除异常增殖的细胞非常重要，细胞必需随时决定是完成有丝分裂，还是为修复损伤停滞生长，如果损伤太严重无法修复细胞凋亡就发生，所以凋亡和增殖通过细胞周期密切联系，细胞周期的调节子既能影响细胞分裂又能影响细胞凋亡。

真核生物细胞周期进程由周期素（ｅｙｅｌｉｎ）和周期素依赖性激酶（ｅｙｃｌｉｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ；Ｃｄｋｓ）共同驱动，当某一时相表达充分后可适时转入下一个时相。

如在脊椎动物，ＧＩ期事件由Ｃｄｋ４，６一ｃｙｃｌｉｎＤ复合物控制，
Ｃｄｋ２－ｃｙｃｌｉｎＥ复合物是Ｇ１ｊｓ期转变必需的，Ｃｄｋｌ—ｃｙｃｌｉｎＡ可促进细胞进入有丝分裂期。

Ｃｄｋｓ抑制剂（ＣＫＩ）可通过与ｃｙｃｌｉｎ／Ｃｄｋｓ复合体的结合抑制Ｃｄｋｓ的活性，使细胞周期有足够的时间停留在某一阶段，充分完成特定时相的任务。

现已确定两个ＣＫＩ蛋白家族，ｐ２１家族由ｐ２１、ｐ２７和ｐ５７组成，可抑制多数Ｃｄｋ—ｃｙｃｌｉｎ复合物的活性；／ＮＫ４家族包括ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８和ｐ１９，主要抑制Ｃｄｋ４的活性。

各种细胞周期调节因子在必需它们的时相出现，在不需要它们的时相减少，现已明确ＵＰＰ介导的蛋白降解是调控细胞周期进程的普遍机制㈣，周期素ＣｙｃＡ、ＣｙｃＢ、ＣｙｃＤ、ＣｙｃＥ，周期素抑制物ｐ１９ⅢＫ４。

、ｐ２１。

１…、ｐ２７”１ｐ１、ｐ５７¨Ｐ２、Ｓｉｃｌ、Ｆａｒｌ、Ｒｕｒａｌ，以及其它调节细胞周期相关事件的ｃｄｅ６、Ｅ２Ｆ－１等均接受
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Ｕｂ化降解。

如在哺乳动物细胞ｐ２７脚１可抑制Ｇ１－－＋Ｓ期转变，在细胞完成向Ｓ期转变的准备工作后，ＵＰＰ即可介导ｐ２７的降解㈣，实现Ｇｌ斗ｓ期的转变。

参与此反应的Ｅ２为Ｃｄｃ３４，Ｅ３为ＳＣＦ复合物家族成员，此复合物由ｐ１９ＳｋｉｐＩ、Ｃｕｌｌ、Ｄ４５Ｓｋｐ２、和环指状蛋白Ｒｏｃｌ组成。

姐妹染色体的分离和有丝分裂末期到Ｇ１期的转变依赖另一个Ｅ３家族成员ＡＰＣ的调节。

ＡＰＣ的底物是含有丝分裂破坏盒的Ａ型和Ｂ型周期素。

ＵＰＰ对上述各种调节因子在特定时相高度选择性的降解，使促进和抑制两方面因素配合默契，细胞顺利通过整个细胞周期。

应用蛋白酶体抑制剂后，Ｎｅｕｒ０２Ａ、ＭＧ．６３、ＣＨＯ细胞停滞于Ｇ１／Ｓ，ＨｅＬａ细胞停滞于ＧＵＭ【２Ｊ，这些现象的发生可能是因为在某一时相应该通过Ｕｂ化降解的调节因子由于ｕＰＰ受到抑制而依旧保持在较高水平，这与下一时相的调节因子产生了矛盾，引起混乱，细胞周期不能顺利进行，为凋亡的介入提供了机会。

最后只能以细胞自身破坏即细胞凋亡的方式解决，如小鼠淋巴瘤细胞ＲＶＣ经过蛋白酶体抑制剂处理后，亚Ｇ１期细胞增多且伴有凋亡。

２３ＮＦ．ｖ．Ｂ途径
ＮＦ．ＫＢ是～个核转录因子，活性ＮＦ．ＫＢ的产生依赖Ｕｂ系统［１７，１８】。

通常情况下ＮＦ．ｖｄ３的前体ｐ１０５以Ｕｂ依赖的方式在２６ｓ蛋白酶体中降解为成熟的ｐ５０形式［】９】，ｐ５０和ＲｅｌＡ（ｐ６５）组成异二聚体并与抑制性因子ＩｑｃＢ结合在一起，在胞浆中呈无活性状态。

当有外界信号刺激时，Ｉ－ＫＢ的３２位和３６位丝氨酸被ＭＥＫＫｌ（一种激酶复合物）磷酸化，在Ｅ２－－Ｃｄｃ３４协同作用下Ｅ３－－ＳＣＦＤ。

Ｔ”Ｐ可介导磷酸化Ｉ－ｖｄ３的Ｕｂ化降解，释放出有活性的ＮＦ．ＫＢ，进入细胞核内启动相关基因的转录。

靶基因中有些可编码抗凋亡蛋白，如ＬＡＰ、ＳＯＤ和Ａ２０。

ＵＰＰ系统受到抑制后，活性ＮＦ．ＫＢ的产生受阻，抗凋亡蛋白水平降低，容易引发凋亡。

３结语
ＵＰＰ不仅直接影响凋亡过程的调控因子，还可通过调控细胞周期进程、转录因子等间接影响凋亡。

ＵＰＰ在细胞凋亡中的作用主要是通过促进细胞分化和增殖，参与ＤＮＡ损伤的修复，降解ｐ５３等而抑制细胞凋亡的发生，是极有潜力的调控细胞凋亡的靶通路。

而特异性蛋白酶体抑制剂可诱导多种肿瘤细胞系凋亡，为恶性肿瘤的治疗提供了新思路。

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