基因工程复习

1基因克隆载体通过不同途径能将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA克隆载体或基因克隆载体。

2成为克隆载体DNA分子必须具备的主要条件

⏹1在宿主细胞内能独立复制

⏹2有选择性标记基因

⏹3有一段多克隆点，外源DNA插入其中不影响载体的复制

⏹4分子量小，拷贝数多

⏹5容易从宿主细胞中分离出来

3载体分类（一般了解

从构建克隆载体DNA来源分

质粒克隆载体病毒或噬菌体克隆载体质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的克隆载体，以及质粒DNA与染色体DNA片段组成的克隆载体

从应用范围有表达型克隆载体启动子探针型克隆克隆载体和cDNA克隆载体等

从应用对象原核生物克隆载体植物克隆载体和动物克隆载体

4质粒是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露的双链分子，一个质粒就是一个DNA分子。质粒不亲和性不同质粒有的可共存于同一细胞之中，但有的不行。把能寓于一细胞中的不同质粒称为亲和性质粒，相反不能同寓于一细胞中的不同质粒称为不溶性质粒

5构建λ噬菌体克隆载体的基本策略和技术路线

● 1 用限制性核酸内切酶切去DNA上的非限制区

●2在λDNA 的非必需内组入选择标记基因

●3建立重组DNA分子体外包装系统

6λ噬菌体克隆载体特点分子量大概40000bp左右基因组有50个以上限制性核酸内切酶识别位点噬菌体的生长途径

柯斯质粒载体 1 分子量大小4~6kb 2具有PBR322质粒的复制子，抗药性基因和几个限制性酶的单一位点3抗菌素4具有噬菌体的某些特性：DNA的cos序列和控制包装的序列5高容量的克隆能力

7以PBR322为代表分析五大基本特点为什么是标志性基因分子量大，改造后变小了？pBR322：松弛型复制拷贝数50 - 100 / cell 氯霉素可扩增用于基因克隆

优点（体现五大基本特点）

1分子量小：4363bp, 容易纯化。

2 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都

含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I（限制性核酸内切酶）切开，而四环素抗性基因可被Bam H I, Hin d III（限制性核酸内切酶）切开，并且这些限制性核酸内切酶在此质粒克隆载体只有一个识别序列，通过插入失活筛选重组子。

3 受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到50-100个，而在蛋白质

合成抑制剂存在条件下，如氯霉素，可达到1000-3000拷贝。

8 Puc质粒

从PBR322改造过来，它比PBR322有更多的优点，分子量更小，标记性基因更容易检测，使用更广泛。

pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。

PBR322改造来的Puc质粒的结构特点

A来源于PBR322的复制起点

B有Ampr共同基因（不再含有原来的

C含有大肠杆菌的β-半乳糖苷酸酶

9 目的基因的制备方法

1 直接分离法（目的基因已掌握，才能用）

A基因分离的物理化学法（一般了解）

a密度梯度离心法b单链酶解法 c 分子杂交法

B双抗体免疫法分离编码蛋白的基因

其基本原理：核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖核蛋白。从细胞匀浆液中制备这种多聚核糖核蛋白体，并同由待分离基因表达的蛋白产物制备的特定抗体一起保温，形成多聚核糖体同抗体的复合物。这种复合体数量少，难以从细胞总多聚核糖体分离出来。但加入由此特定蛋白的抗体产生的第二抗体时就可以通过不连续蔗糖梯度离心，将所要的含有特定mRNA多聚核糖体从总多聚核糖体分离出来，再通过酚、氯仿抽提去除蛋白，柱层析，就可以得到特定蛋白编码的mRNA。

C利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因

以目的基因的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成互补的DNA，即cDNA，然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段，与适当的载体重组后转入受体菌，获得目的基因的cDNA克隆。

2构建基因组文库法（目的基因不能查到，没有资料可查）

A 基因组文库某种生物的基因组的全部遗传性息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为这种生物的基因文库。

步骤用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的氨基酸片段R有机的连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖的构成各个片段的无性繁殖克隆，在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一克隆的总体被称为生物的基因文库

B cDNA基因文库是以mRNA合成的互补cDNA为基础构建的。如果群体中只贮存该基因组的部分成分，则称为部分cDNA基因文库。

cDNA基因文库构建的一般步骤（过程要分析，不能简单的回答）

（1）总mRNA提取与mRNA的分离纯化

原理：利用mRNA都有一段PolyA 尾巴将mRNA从总RNA（tRNA、rRNA）。提取总RNA 有商业化的试剂盒，分离mRNA用商业化的oligod纤维柱，根据已知的序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化特定的mRNA，与探针碱基互补的mRNA结合到柱上（2）cDNA的合成与克隆

关键因素1 模板mRNA 2反转录酶

常用引物1 oligo-dT 2 6聚体寡核苷酸

1第一条cDNA链合成：T引物与mRNA退火反转录反应

2第二条cDNA链的合成：

a. 第一条cDNA链3’-末端加尾（dCTP）

b. 限制酶切除去载体上所加的多聚C尾巴

c. 与G引物退火

d. 除去RNA

e. 合成第二条cDNA链

（3 ）cDNA与载体连接

⏹人工接头：要求具平端ds- cDNA，酶切时可能导致某些cDNA链断裂

⏹同聚物加尾：可大大减少载体DNA自身连接

⏹cDNA的定向插入

（4）噬菌体的包装、转染及质粒DNA的转化

目的cDNA的鉴定：用探针杂交、克隆所表达的蛋白质进行抗体检测或直接对克隆的cDNA 测序

（5 ）特定cDNA的克隆

1 从已知的蛋白的基因序列设计特异性的引物，合成cDNA。

3 利用PCR反应扩增目的基因

如果知道目的基因的全序列或其两侧序列，可以通过合成一对与模板DNA互补的引物，十分有效地扩增出所需的DNA片段。

要求待扩增片段必须一致的，至少DNA片段两端长约20kb的序列已知。

4基因的化学合成（仅适用于短片段）

基因的化学本质实际上就是一段具有特定生物学功能的核苷酸序列，由鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶等四种碱基组成，如果是RNA片段，胸腺嘧啶被尿嘧啶所取代。

10 目的基因的分离

1 目的基因的功能克隆

（1）根据特异蛋白分离目的基因

基本过程是，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他蛋白分离技术从生物体的组织和器官中分离出一定发育时期的特异蛋白，应用蛋白质测序技术测定特异氨基酸序列，然后按照遗传密按照遗传密码，人工合成一段寡核苷酸片段作为探针，从cDNA文库或基因组文库中筛选相应的基因。

A 聚丙烯酰胺凝胶电泳B蛋白质测序技术测定特异氨基酸序，按照遗传密按照遗传密码C人工合成一段寡核苷酸片段作为探针，从cDNA文库或基因组文库中筛选相应的基因。（过程）

（2）功能互补克隆法

原理：利用被克隆DNA片段与宿主细胞染色体在功能上有同源互补性来进行目的基因分离方法：将大肠杆菌DNA克隆片段“库”中的重组DNA分子分别导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株的受体细胞，然后将此受体细胞涂布在一种营养缺少该菌株所需要的营养底物的基本培养基上。