第三章-细胞生物学的研究方法

TEM
0.1 nm
电磁透镜
要求真空 1.33x10-5～ 1.33x10-3Pa
利用样品对电子的散射和 透射形成明暗反差
主要区别 （1）光源不同 光镜为可见光或紫外线；电镜为电子束 （2）透镜不同 光镜为玻璃；电镜为电磁透镜 （3）真空系统 （4）显示记录系统
超薄切片技术
固定、脱水、包埋、切片、染色。
Figure 3-23. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For comparison, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thinsection electron microscopy (C).
（四）其它光学显微镜
相差显微镜（phase-contrast microscope）
一种将相位差转变成振幅差（明暗差）的显微镜，可观 察不染色的活细胞。 利用样品的不同位点的密度差，形成肉眼可见的明暗区 别。
微分干涉显微镜（differential-interference microscope）
• 主要是用于检测细胞上的特异荧光材料；
• 与普通光学显微镜不同的是增加了两套滤光片。
第一套称为激发光滤片，装在光源和样品之间，只有那
些能激发荧光材料发光的特定波长的光才能通过。 第二套称为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让燃料 所发出的荧光通过。在黑暗背景的衬托下，发出荧光的样
品很容易被观察。
荧光显微镜的光路图
荧光显微镜的应用
• B：不同荧光素所需激发波长与所产生的荧光波长比较 • C：细胞有丝分裂中期的观察。
由于荧光显微镜的暗视野为荧光信号提供了强反差
背景，非常微弱的荧光信号亦可得以分辨。
WT
∆cdc15 CM
MDFA/4 d /DAPI stain (400×)
荧光显微镜观察真菌的细胞核
（三）激光共焦点扫描显微镜
决定光学显微镜的分辨率的要素
D ＝ 0.61 λ∕［N · sin(α/2)］
• • • •
D: 分辨率 λ：入射光的波长 N：介质的折射率（1或1.5） α：物镜的镜口角
（一）普通复式光学显微镜
分辨率
指区分开两个质点间的最小距离。
D=0.61λ/N×sin (a/2)
两个质点之间的距离取决于光源波长λ ，物镜镜口
普通光学显微镜
分辨率与所用 波长成反比！
用浸没油取代空气的作用?
介质折射率提高 改变光折射角度 分辨率得到提高 增加照明亮度
浸没油与玻璃的折射率相近 很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。
普通光镜的观察
步 骤：
取材－固定－脱水－包埋－切 片－脱蜡－复水－染色－脱水 －透明－封片－观察
普通光学显微镜成像原理
物镜得到物体放大的 实像; 目镜把物镜成的像进
一步放大。
显微镜和显微技术
几个基本概念： 放大 被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！ 分辨率 反差
能辨别两点之间最小距离的能力 被观察物区别于背景的程度
与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微 镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。
embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-offocus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.
基本要求： 1. 细胞精细结构保存良好，不产生明显的物质凝聚、丢失
或添加人工效应等；
2. 切片厚度在500埃左右，最大不超过1000埃（1mm厚的 样品切成20000片；一个一般大小的细胞要切成300片） 3. 切片应耐受电子束的轰击，包埋介质不发生变形； 4. 切片应具有良好的反差；
5. 切片需均匀，没有皱褶、刀痕及染色剂沉淀等缺陷。
Specimen Preparation for Electron Microscopy
Thin Sectioning for TEM
The wax sections: 3-10um;
The Plastic ultrathinsections for TEM: 40-50nm Sections of LM: >5um; Sections of TEM: <100nm
激光扫描共焦显微镜的原理图
原理：激光束经双色 镜反射后，通过物镜 聚集到样品某一焦点； 从焦点发射的荧光经 透镜汇聚成像，被检
测出；其他部位发射
的荧光不聚焦成像，
不能检测到。
荧光显微镜（A）和激光扫描共焦显微镜 （B）所观察图像的比较
小鼠肾小球的厚切片
Figure 3-14. Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila
超薄切片技术显示的动物细胞超微结构
家蚕细小病毒负染色电镜照片（病毒直 径20nm）
II. Scanning electron microscope (SEM)
Images of surfaces can be obtained by SEM;
Critical-point drying;
Range: 15－150,000 X. Resolution: 5nm
激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope， CLSM）： 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫 描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光 的聚焦点，也是瞬时成像的物点。 特点：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率 (1.4-1.7)， 可重构样品的三维结构, 主要用来研究细胞亚结构。
电子显微镜的基本结构（A）和成像 原理（B）
电子显微镜与光学显微镜的区别
显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理
LM
200 nm
100 nm
可见光 （400-700） 紫外光 （约200 nm)
电子束 （0.01-0.9）
玻璃透镜
玻璃透镜
不要求真空
不要求真空
利用样品对光的吸收形成 明暗反差和颜色变化
电镜超薄切片样本制备示意图
Figure 3-20. Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus,wenku.baidu.comvacuoles,
mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen.
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞及其组分的分析方法 第三节 细胞培养与细胞工程 第四节 细胞及生物大分子的动态变化
第五节 模式生物与功能基因组的研究
第一节 细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜
一、光学显微镜技术
☆ 基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统
三、隧道扫描显微镜
原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互 作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、 磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌 信息、电特性或磁特性等。 特点：（ 1 ）可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领 高。（侧分辨率为0.1～0.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； （2）可实时得到样品表面三维图象，可测量厚度信息； （3）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；非破坏性测
Making tissue sections. How an embedded tissue is sectioned with a microtome in preparation for examination in the light microscope.
观察结果
（二）荧光显微镜技术
是光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具。
The optical system of a modern fluorescence microscope. A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic (beam-splitting) mirror (2). In this example the filter set for detection of the fluorescent molecule fluorescein is shown.
Figure 3-32. Cells in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish.
扫描电镜原理示意图（A），扫描电镜下可清 晰地显示原生动物四膜虫表面的纤毛和口器 （B）
荧光染料分子
Fluorescent dyes. The structures of fluorescein and tetramethylrhodamine, two dyes that are commonly used for fluorescence microscopy. Fluorescein emits green light, whereas the rhodamine dye emits red light.
二、电子显微镜
（一）、电子显微镜的基本知识 1. 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 2. 电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数 3. 电子显微镜的基本构造 （二）、主要电镜制样技术 1. 超薄切片技术 2. 负染色技术 3. 冷冻蚀刻技术 4. 电镜三维重构与低温电镜技术 5. 扫描电镜技术
二、电子显微镜技术
一种将样品厚度上的微小区别转化成明暗区别相差显微镜。
录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
相差显微镜观察真菌菌丝
2d
WT
3d
∆cdc15
CM
两种不同类型的光学显微镜所拍摄的图 像比较
体外培养的MDCK细胞 的图像 • A: 普通显微镜所拍 • B：相差显微镜所拍
量；
（4）可连续成像，进行动态观察。 用途：纳米生物学研究领域中的重要工具 ,在原子水平上揭示样本表 面的结构。
几种显微镜可观察的样品大小（箭头之 间的范围）及其分辨能力（右侧箭头所 指位置）
• 分辨率：能区分开两个质点间的最小距离 • 眼睛、光学显微镜和电子显微镜的分辨率分别为：0.2mm、 0.2μm和0.2nm。
角a和介质折射率N 空气（N=1.0）、水（N=1.33）、香柏油（N=1.52）
显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？
目镜：10 ~ 15 ×；物镜： 100 ×；总放大倍数1000~1500 ×；
如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？
使用油镜，即在100×物镜和载玻片之间滴加香柏油；