微生物检验基本技能

物理消毒灭菌法
热力灭菌法 辐射杀菌法 滤过除菌法 超声波杀菌法 干燥与低温抑菌法
热力灭菌法
干热灭菌法— 焚烧：废弃物、尸体
灼烧：接种环、试管口 干烤：玻璃器皿 红外线：医疗器械
湿热灭菌法— 巴氏消毒法：61.6-62.8 ℃30min或71.7
℃15-30s,主要用于牛乳消毒。
煮沸法 流动蒸汽消毒法 间歇蒸汽消毒法 高压蒸汽灭菌法
光滑型菌落 粗糙型菌落
粘液型菌落
细菌在固体培养基中的生长情况
细菌在液体培养基中的生长情况
菌膜
对照
菌沉淀
均匀浑浊
细菌在半固体培养基中的生长情况
1、3：有动力
2：无动力
细菌的代谢产物
（一）分解代谢产物和细菌的生化反应 不同的细菌 含有不同的分解代谢的酶 具有不同的分解代谢途径 对同一营养物质的分解代 谢及其产物有所不同
(二)低温定期移植法
斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷
容易发生遗传变异，连续传代可使一些性状 丢失或减弱，也易于污染杂菌。因此，一些 贵重菌株不宜用此法保藏。
(三)石蜡油低温保藏法
原理：是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的 液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于 生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水 分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的 目的。保藏温度要求在-4～4℃下。液体石蜡 法适用于不产孢子的菌种。
1.5ug 0-4ug 0.025ug
微生物的营养要求
5.无机盐 为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要 元素（包括大量元素和微量元素）的物质，多以 无机盐的形式共给。
大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe （10-3~10-4mol/L）
微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co （10-6~10-8mol/L）
这是一种常用的简便方法。 放在4℃冰箱内保藏，这种温度条件下不能使菌体进入休眠， 而仅是抑制微生物的生命活动。因此，保藏时间不宜过长，一般不 超过1～2个月为宜。 本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的水平活性下，这对保 藏株的性状是不利的，因此，生产菌种一般不采用此法保藏。
(二)低温定期移植法
斜面：把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，定期移植， 一般3～6百度文库月移植一次(视菌种特征而定)。 穿刺培养定期移植法：保藏细菌效果较好。穿刺培养是将含 0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖 挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养， 待菌长好后即可放低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保 藏2年以上不发生明显变异。
无机盐的生理功能
细胞内一般分子成分（P、S、Ca、Ma 、Fe等） 一般功能 渗透压的维持（Na+等）
生理调节物质
大量元素 无
酶的激活剂（M a2+等）
pH的稳定
化能自养菌的能源（S、Fe2+、NH4+、NO2-等）
机
盐
特殊功能
无氧呼吸时的氢受体（NO3-、SO42-等） 酶的激活剂（Cu2+、Mn2+ 、Zn2+等）
有 机 氮
尿素、一般氨基酸、简单蛋白 尿素、蛋白胨、明胶等 质等 NH3、铵盐等 (NH4)2SO4等
N· O
N
硝酸盐等
N2
KNO3等
空气
微生物的营养要求
3.能源
能为微生物的生命活动提供最初能量来源营养物或辐射能
有机物 化学物质 能源谱 辐射能 无机物
化能异养微生物的能源 化能自养微生物的能源
光能自养和光能异养微生物的能源
细菌的培养基及性状观察
厌氧罐
三、细菌的分离培养及性状观察
在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。 从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是 指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁 殖而产生的后代。 分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂 菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中 分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养 物移植培养。
糖发酵试验 VP试验 甲基红试验 枸橼酸盐利用试验 吲哚试验
硫化氢试验
尿素酶试验 自动化仪器分析
细菌的代谢产物
分解代谢产物和细菌的生化反应
VP试验 糖 的 发 酵 甲基红试验 单糖发酵试验
蛋 白 质 的 发 酵
吲哚试验 其 他 试 验 尿素酶试验
硫化氢试验
枸橼酸盐利用试验
糖发酵试验
培养基的类型及应用
按 用 途 不 同 划 分 基础培养基
含有一般微生物生长繁殖所需的 基本营养物质的培养基 特殊营养物质包括血液、血清、酵 母浸膏、动植物组织液等
加富培养基
选择培养基 鉴别培养基
用来将某种或某类微生物从混杂的 微生物群体中分离出来的培养基
微生物产生某种代谢产物，与培养 基中的特殊化学物质发生特定的化 学反应，产生明显的特征变化
化剂、表面活性剂、烷化剂。
消毒剂的应用：病人排泄物与分泌物、皮肤、
粘膜、饮水、厕所、空气、手。
影响消毒灭菌效果的因素
消毒剂的性质、浓度与作用时间 微生物的种类与数量 温度 酸碱度 有机物
二、 培养基(culture medium)
培养基：是由人工方法培配置而成的，专供微生 物生长繁殖使用的混合营养物制品。
增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。
如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡， 同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死
亡，影响也较小。
与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都 是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。
(一)低温保藏法
微生物的营养要求
4.生长因子
那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物 自身不能合成的或合成量不足以满足机体生长需要 的有机化合物 。 微 生 物 生长因子 胆碱 硫胺素 需要量（ml-1） 6ug 0.5ng
III型肺炎链球菌 金黄色葡萄球菌
白喉棒杆菌 破伤风梭状芽孢杆菌 肠膜状串珠菌
B-丙氨酸 尿嘧啶 吡哆醛
微量元素
特殊分子结构成分（Co、Mo等）
微生物的营养要求
6.水
水的生理功能（PAGE80）
①起到溶剂与运输介质的作用，营养物质的吸收与代谢产 物的分泌必须以水为介质才能完成； ②参与细胞内一系列化学反应； ③维持蛋白质、核酸等生物大分子稳定的天然构象； ④因为水的比热高，是热的良好导体，能有效地吸收代谢 过程中产生的热并及时地将热迅速散发出体外，大而有效 地控制细胞内温度的变化； ⑤通过水合作用与脱水作用控制由多亚基组成的结构，如 微管、鞭毛的组装与解离。 ⑥保持充足的水分是细胞维持自身正常形态的重要因素。
(三)石蜡油低温保藏法
具体操作： 菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长； 选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经 过121℃高压蒸汽灭菌1～2h，将其放烘箱中 (160℃左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水 分； 待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入 斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以 高出斜面顶部约1cm左右为宜。
一、菌种保藏
现行的菌种保藏方法有下列诸种: (一)低温保藏法 (二)低温定期移植法 (三)石蜡油低温保藏法 (四)干燥保藏 (五)甘油管保藏法 (六)真空冷冻干燥法 (七)液氮超低温保存
低温保藏菌种
低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。 在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。 在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度
一、消毒与灭菌
消毒(disinfection)：杀死物体上病原微生物的方法，并不一定 能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。用以消毒的药品称为消毒 剂(disinfectant)。 灭菌(sterilization)：杀灭物体上所有微生物的方法。灭菌比消 毒要求高，包括杀灭细菌芽胞在内的全部病原微生物和非病原微 生物。 抑菌(bacteriostasis)：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。常用 的抑菌剂为各种抗生素。 防腐(antisepsis)：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。细菌 一般不死亡。 无菌(asepsis)：不存在活菌。
菌落的形状、边缘和表面构造 1.圆形、边缘整齐、表面光滑；2．圆形、边缘整齐、表面有同心圆 ；3．圆形、叶状边缘、表面有放射状皱褶；4．圆形、锯齿状边缘 、表面较不光滑；5．不规则形、波浪状边缘、表面有不规则皱纹 ；6．圆形、边缘残缺不全、表面呈颗粒状；7．毛状 ；8根状
细菌在固体培养基中的生长情况
微生物检验基本技能
微生物及免疫学科组
内 容
•
•
无菌技术
安全要求
•
•
微生物分离培养（细菌）
微生物保藏
微生物检验技术
1.形态学检测技术（染色、镜检技术） 3.基于生理生化特征的检测技术
2.培养特征检测技术（计数、生长性状） 4.致病性检测技术
5.药物敏感性检验技术 6.血清学检测技术
微生物检验技术
细菌生化鉴定管编码
肠杆菌科细菌生化鉴定管
非发酵细菌生化鉴定管 弧菌科细菌生化鉴定管 奈瑟氏菌细菌生化鉴定管 酵母样真菌糖同化试验鉴定管
糖发酵实验
将糖发酵管甩至两端，标记后折断，每组细菌接种 于两套糖发酵管中，倒立37℃培养24h。
药敏试验
药敏试验
药敏试验
菌种的保藏与复壮
菌种衰退的基本原因是变异，变异是不 可避免的，而减缓变异速度则是可能的。 不良环境条件能促进变异，频繁或过多 传代也是造成衰退变异的重要原因。 为菌种创造良好条件，减缓菌种衰退， 这就是菌种保藏与复壮工作。
碳源 氮源 能源
无机盐 生长因子 水
微生物的碳源谱
类 型 元素水平 化合物水平 培养基原料水平 牛肉膏、蛋白胨、 花生饼粉等 一般氨基酸、明胶等
C· O· X H· N·
C· O· H· N C· O H· C· H 无 机 碳
复杂蛋白质、核酸等
多数氨基酸、简单蛋白 质等
有 机 碳
糖、有机酸、醇、脂类 等
细菌的营养物质
二. 细菌的营养物质：水、碳源、氮源、无机盐、生长因子。
基本概念
营养物质:能够满足机体生长、繁殖和完成各种生理 活动所需要的物质。 营养:微生物获得和利用营养物质的过程。
营养物质是微生物生存的物质基础，而营养是微生 物维持和延续其生命形式的一种生理过程。
微生物的营养要求
二、营养物质及其生理功能
辐射杀菌法
• 紫外线
波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用。
其主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个胸腺嘧 啶共价结合形成二聚体，导致细菌变异和死亡。
• 电离辐射
高速电子、X射线、γ射线
• 微波
波长1mm~1m
滤过除菌法
赛氏滤器 玻璃滤器 薄膜滤器
化学消毒灭菌法
消毒剂的种类：酚类、醇类、重金属盐类、氧
一、菌种保藏
微生物菌种保藏目的是要使菌种性状 保持稳定,力求把这种衰退现象推迟减缓 到最低限度。
菌种保藏
菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株 的性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。 保藏是将获得的纯菌种以其休眠和停止生长的条 件下保藏。 微生物生长要求适宜的温度、水分、空气和营养 物质等，如将菌种处于低温、干燥、无氧和缺乏 营养的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。
7.免疫荧光抗体技术 8.酶联免疫技术 9.放射免疫分析技术 10.免疫金技术 11.抗体芯片技术 12.复合检测技术 免疫PCR技术 13. 微生物自动化仪器与检测技术 14. 生物传感器检测技术
微生物分子生物学检验技术
核酸探针技术， PCR技术， 环介导等温扩增技术， 荧光定量PCR技术， 固相基因芯片技术， 液相基因芯片技术。
按其物理状态分类：固体培养基、液体培养基、半固体培养基。 按其成分分类：合成培养基、天然培养基。
细菌的生长的环境因素
1. 营养物质 2. 氢离子浓度(pH) 3. 温度 4. 渗透压 5. 气体——专性需氧菌：具有完善的呼吸酶系统，仅能在有氧环境下生长。
微需氧菌：在低氧压（5%-6%）生长最好。 兼性厌氧菌：兼有有氧呼吸和无氧发酵两种功能，但以有氧时 生长较好。大多数病原菌属于此。 专性厌氧菌：缺乏完善的呼吸酶系统（氧化还原电势高的呼吸 酶、分解有毒氧基团的酶），只能在无氧环境中 进行发酵。
烃类
葡萄糖、蔗糖、各种淀粉、 糖蜜等
天然气、石油及其不同馏份、 石蜡油等
C(?)
C· O
—
CO2
—
CO2
C· X O·
NaHCO3
NaHCO3、CaCO3、等
微生物的氮源谱
类 型 元素水平 N· H· X C· O· N· H· C· O N· H 无 机 氮 化合物水平 复杂蛋白质、核酸等 培养基原料水平 牛肉膏、酵母膏、饼粕 粉、蚕蛹粉等