腺病毒包装注意事项

细胞中大量扩增腺病毒293在

细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293

由于一个细胞中按这一方法最终得到的病毒量约为病毒感染周期的基本方法，3×1011～3×1012。病毒

颗粒。如果要把病毒用所含的病毒颗粒为1000～10000，因此10125×1L 培养细胞可得到约的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达，则氯化铯梯度离心纯化，则必须至少×1083根据蛋根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)步。如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病

毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病

毒的可能性会大大降低。

操作步骤：

细胞。51 在100 培养皿或752培养瓶中加入10 5%培养×106293

。取2 0.5 首次扩增的病毒保存液，加入5%至1，混匀，这样稀释得到的5值约为

孵箱中培3 3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动次，37℃2

分钟。养90

。4 加入9 5%

测定以估计病毒个病毒颗粒，进行××这时在5 再培养72 小时，10 溶液中大约有5109～51010颗粒。分钟沉离心5 600注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。收集细胞，×g

-200C /370C 1)病毒保存溶液重悬细胞。即一般为原始体积的去上清后加入最小体积淀细胞，(1/10

次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。3 冻融

次。/37℃℃冻融3 1 -20

℃。-20 ℃或-80 转入215 无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10 分钟，收集上清冻存于

细胞进行培养。1752培养瓶中各加入107 293 3 3 个

混合液，十字形慢5 12 5%中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入细胞裂解液上清加入4 将3

。值约为25次，慢晃动混匀3 370C 52 孵箱中培养90 分钟。此时

。至305 加入5%

测定以估～～再培养4872 小时。此时10 培养液病毒量约为3×10103×1011。若需要，进行6

计病毒滴度。

分钟收集5 离心注：如果此时病毒量已可以满足实验所需，则可立即进入病毒滴定步骤。600×g

次，台式离心机上以最3 冻融细胞，弃上清，加入1/10 原始体积的溶液重悬细胞。-200C /370C

大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。

分钟，取出上清保存。10 12. 移入50 离心管中，台式离心机上最大速率离心

细胞。107 293 13. 30 瓶175 2 培养瓶中每瓶各加入

混合液感染细胞，十混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5 14. 将45 细胞裂解液上清加入105 5%。分钟。此时值约为2590 3 字形缓慢晃动次混匀，370C 培养

瓶。5%至3015. 加入

测定估计病毒滴度。个病毒。若需要，进行1012×3～1011×3小时，此时约有48-72 再培养16. 次，离心沉5 冻融5%/370C 如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在中。-200C 3

淀细胞碎片。此时5 5%中3×1011～3×1012个病毒颗粒，浓度为6×1010～6×1011。然后测定病毒滴度，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。

在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010 细胞中扩增则有一定技术性。切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加产生量。有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低产量。如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。如果需要大于扩增4 轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。比如，用第2 代病毒产生第3 代病毒。如果没有第2 代病毒，那么必须用第1 代病毒来产生新的第2 代病毒。按这个原则进行水平尽可能低。扩增可使

如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。细胞沉淀中一般可提取蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。1-5

转染2.5.2

孔细胞板上进行，24具体操作按（）的操作手册进行。转染

在的新生牛血清（不含293A在转染的前一天，消化细胞，用10%

孔细24抗生素）稀释细胞，使其密度达到2.5×105个细胞，在，，

52、37℃饱和湿度下培养；在转染前4h1.0胞板上每孔接种孔细胞板的营养液更换为新的营养液；取出－20℃保存的把24200μL 转染试剂，室温融化并涡漩；在灭菌的玻璃瓶中先加入的，，然后加入37℃预热的无血清培养基（或不含血清的）1.0μg1∶1）与质量/μg比为混匀后加入3.0μL的（使∶的体积/μL；从二氧化碳细胞培养15 后立即涡漩，在室温温育混合物l0～混合物，把混合箱中取出细胞板，弃去上清；再一次短暂涡漩

以免细胞物轻轻加入到细胞面上，注意不要直接吹到细胞面上，脱落；轻轻混匀，使脂质体混合物覆盖细胞面，然后立即把细胞1.0 37℃预热后，轻轻加入板放入二氧化碳培养箱中；温育1.0h，把细胞放入二氧化）6%～2的完全生长液（或使血清浓度降到．7碳培养箱，37℃培养～14d。重组腺病毒的收获与增殖2.5.3 当转染的细胞出现特征病变（局部细胞变圆、脱落，成网状）

冻融后接种长－20℃冻存收获病毒。或细胞状态不足以维持时，维持液1.0h孔细胞板，37℃吸附，每孔加入2.0细胞的满293A6，增殖病毒。（含2%血清的）

左右线性转染只有在包装成病毒后才能表达，至少也得5d

80℃保存，一般短时间病毒可以保存在-20-度，但是病毒最好在）病毒2, 4% 特别是纯化之后。在最佳的缓冲液（10 8.0, 2 20℃下长-年稳定性；会持续1-2病毒不能反复冻融；建议不要在期保存。但通常比在缓冲液病毒在中用血清保存的方式与纯化颗