腺病毒包装注意事项

细胞中大量扩增腺病毒293在
细胞中进行大量扩增。

本手册提供了递增培养规模和腺一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293
由于一个细胞中按这一方法最终得到的病毒量约为病毒感染周期的基本方法，3×1011～3×1012。

病毒
颗粒。

如果要把病毒用所含的病毒颗粒为1000～10000，因此10125×1L 培养细胞可得到约的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。

对于蛋白表达，则氯化铯梯度离心纯化，则必须至少×1083根据蛋根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(。

为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)步。

如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。

注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病
毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。

每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病
毒的可能性会大大降低。

操作步骤：
细胞。

51 在100 培养皿或752培养瓶中加入10 5%培养×106293。

取2 0.5 首次扩增的病毒保存液，加入5%至1，混匀，这样稀释得到的5值约为
孵箱中培3 3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动次，37℃2
分钟。

养90。

4 加入9 5%
测定以估计病毒个病毒颗粒，进行××这时在5 再培养72 小时，10 溶液中大约有5109～51010颗粒。

分钟沉离心5 600注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。

收集细胞，×g
-200C /370C 1)病毒保存溶液重悬细胞。

即一般为原始体积的去上清后加入最小体积淀细胞，(1/10
次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。

3 冻融
次。

/37℃℃冻融3 1 -20
℃。

-20 ℃或-80 转入215 无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10 分钟，收集上清冻存于
细胞进行培养。

1752培养瓶中各加入107 293 3 3 个
混合液，十字形慢5 12 5%中，混匀。

移去细胞培养液，每瓶小心加入细胞裂解液上清加入4 将3。

值约为25次，慢晃动混匀3 370C 52 孵箱中培养90 分钟。

此时。

至305 加入5%
测定以估～～再培养4872 小时。

此时10 培养液病毒量约为3×10103×1011。

若需要，进行6
计病毒滴度。

分钟收集5 离心注：如果此时病毒量已可以满足实验所需，则可立即进入病毒滴定步骤。

600×g
次，台式离心机上以最3 冻融细胞，弃上清，加入1/10 原始体积的溶液重悬细胞。

-200C /370C
大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。

分钟，取出上清保存。

10 12. 移入50 离心管中，台式离心机上最大速率离心
细胞。

107 293 13. 30 瓶175 2 培养瓶中每瓶各加入
混合液感染细胞，十混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5 14. 将45 细胞裂解液上清加入105 5%。

分钟。

此时值约为2590 3 字形缓慢晃动次混匀，370C 培养
瓶。

5%至3015. 加入
测定估计病毒滴度。

个病毒。

若需要，进行1012×3～1011×3小时，此时约有48-72 再培养16. 次，离心沉5 冻融5%/370C 如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在中。

-200C 3
淀细胞碎片。

此时5 5%中3×1011～3×1012个病毒颗粒，浓度为6×1010～6×1011。

然后测定病毒滴度，或者用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒。

在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液，而在1010 细胞中扩增则有一定技术性。

切勿将扩增后的病毒保存液再用来感染细胞，因这会大大增加产生量。

有时不得不使用纯化空斑以最大可能降低产量。

如果已没有纯化的空斑，那么就不得不重新空斑纯化重组病毒，鉴定克隆后再进行扩增。

如果需要大于扩增4 轮后的病毒量，注意请用早期的病毒作为扩增源。

比如，用第2 代病毒产生第3 代病毒。

如果没有第2 代病毒，那么必须用第1 代病毒来产生新的第2 代病毒。

按这个原则进行水平尽可能低。

扩增可使
如果用于表达蛋白，则可以收集细胞后根据蛋白特点选择适当方法抽提蛋白。

细胞沉淀中一般可提取蛋白，建议在小规模扩增后先测定感染后抽提蛋白的最佳时间，然后再大量扩增蛋白。

1-5
转染2.5.2
孔细胞板上进行，24具体操作按（）的操作手册进行。

转染
在的新生牛血清（不含293A在转染的前一天，消化细胞，用10%
孔细24抗生素）稀释细胞，使其密度达到2.5×105个细胞，在，，
52、37℃饱和湿度下培养；在转染前4h1.0胞板上每孔接种孔细胞板的营养液更换为新的营养液；取出－20℃保存的把24200μL 转染试剂，室温融化并涡漩；在灭菌的玻璃瓶中先加入的，，然后加入37℃预热的无血清培养基（或不含血清的）1.0μg1∶1）与质量/μg比为混匀后加入3.0μL的（使∶的体积/μL；从二氧化碳细胞培养15 后立即涡漩，在室温温育混合物l0～混合物，把混合箱中取出细胞板，弃去上清；再一次短暂涡漩
以免细胞物轻轻加入到细胞面上，注意不要直接吹到细胞面上，脱落；轻轻混匀，使脂质体混合物覆盖细胞面，然后立即把细胞1.0 37℃预热后，轻轻加入板放入二氧化碳培养箱中；温育1.0h，把细胞放入二氧化）6%～2的完全生长液（或使血清浓度降到．7碳培养箱，37℃培养～14d。

重组腺病毒的收获与增殖2.5.3 当转染的细胞出现特征病变（局部细胞变圆、脱落，成网状）
冻融后接种长－20℃冻存收获病毒。

或细胞状态不足以维持时，维持液1.0h孔细胞板，37℃吸附，每孔加入2.0细胞的满293A6，增殖病毒。

（含2%血清的）
左右线性转染只有在包装成病毒后才能表达，至少也得5d
80℃保存，一般短时间病毒可以保存在-20-度，但是病毒最好在）病毒2, 4% 特别是纯化之后。

在最佳的缓冲液（10 8.0, 2 20℃下长-年稳定性；会持续1-2病毒不能反复冻融；建议不要在期保存。

但通常比在缓冲液病毒在中用血清保存的方式与纯化颗
粒一致，4℃存储病毒一周以上而不需要中更加稳定。

可以在中用血清在反复冻融。

次以上而滴度不会下降，在经过纯化病毒在中可以反复冻融3080℃下滴度就会至少下降的病毒的情况下，使用缓冲液存储于-。

缓冲液和精确的值对于滴度一个数量级（视保存缓冲液而定）最佳的保持稳定性的储存方法建议使用以下的保存是很关键的。

缓冲液：10 8.0, 2 2 ，4%
5d一般转染后几天之内可以看到零星、散在的荧光，在转染后
以后，如果有腺病毒包装，由于其感染周围的细胞，那么会在腺随着时间病毒包装的地方看到荧光数增加，聚集成一团的样子。

的延长，整个视野荧光数会逐渐增多。

如果转染后荧光数不增加或不明显，这与病毒包装的过程有关。

包装很快，那么很快就能看到明显的荧光。

毕竟不同转染条件、不同目的基因，包装速度是不一样的。

如果细胞没有，细胞状态好的话，可以尽可能地将时间延长，一直维持就可以。

有时候第冻融再接一代有时就等细胞不能维持时，一代都看不到明显的，明显了。

刚转染之后也能看到散在的荧光，包装成功是能看到成团的荧能否包装成功与目的基因也有很大关当然是最确切的证实。

光，是不能系，据不完全统计，在腺病毒包装公司，大约有将近10%时间长短成功的。

当基因对腺病毒有害时常常会出现这种情况。

与
你的转染量、转染效率、基因都有关系。

的具体表现为：细胞变圆、脱落，形成空斑。

有时候第一代很难往往病变难以确定，看到，最后时间长了，与对照细胞差别不大，需要传代一次才会变得明显。

这个过程一般不只要感觉细胞还行就可以。

液体变黄是正常的，都可以。

如果觉得不能维持了，12d需要换液，细胞好可以维持．。

即可以换液，因为此时上清的病毒很少（多的话，早就有了）使到后来，也是细胞中的病毒量高。

我的质粒提取方法重组质粒的小量提取50μ（或加倍）1.的含的单个菌落，接种于盛有3.0挑取转化5a过夜振荡培养（一般氨苄青霉素的培养基的试管中，37°C 220 12-16h，如果浓度低可适当延长时间）；次，也2.取1.5菌液，12000离心30s，沉淀菌体（我一般重复2过一个就是3离心在一个管；试剂盒提我重复4次，也就是说6 柱子）；（不用担心裂解不开），3.完全弃去上清后加入300μL 4℃预冷的溶液I（50葡萄糖；25
8.0；10 ）重悬细菌；，缓慢颠倒离心管数次，4.加入新配制的溶液300μL（0.2 ；1）将离心管置于冰上；，，冰乙酸11.528.5），水60用冰预冷的溶液5.加入225μL（5乙酸钾置冰上盖紧管口，将管倒置后温和颠倒至蛋白变性成白色团块，3～5；6.12000离心5，将上清移至新的离心管中；60；或延长至101-7.加入2μL A（），37℃作用30 5；离心，的酚∶氯仿，颠倒混匀后置
室温加入8.600μL512000取上清到新的离心管，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温9. ；10放置
乙醇洗涤沉淀一次，干燥，加70%离心10.12000l0，弃上清，用双蒸水溶解；入30μL琼脂糖凝胶电泳分析。

11.
天就死亡肯转染后48h看不到荧光也算是正常的，但是细胞第7定是不正常的。

是不是转染量过大，导致脂质体太多，对细胞的没有转染的细胞对照是毒性太大造成的，或者是细胞状态不好，不是好的呢？，1）酶切线性化的体系可以参照一般的酶切体系，我一般是30，但不宜过大，使得酶浓度降低；也效果挺好。

可以放大到50（或者更长）不宜过小，以免有些成分抑制酶切。

一般在酶切3h）与没有酶切的质粒一起跑电影，一看是否后，取几微升（如3如果质粒的带子不见切成了2条带，二看质粒的带型还有没有，条带，就认为酶切完全，此时了，全部切成了大片段和小片段2 可以再延长酶切一段时间。

，这些都是凭感觉，2）汇片指的是细胞融合度在50-70%50-70%不知道你指细胞间隙还是比较大的，时间长了就掌握了。

50-70% 用的什么转染试剂，好像没见要求密度这么小的。

）不同转染试剂的步骤一般都不一样，一般参考说明书就行。

3采用不同的细胞稀释度进行转染。

可以多转染几个孔，条件允许，当然也可以先用质粒摸脂质体与的比例一般采用推荐的就可以，索一下。

．
这是我用的（）的步骤：2.5.2 转染孔细胞板上进行，具体操作按（）的操作手册进行。

转染在24的新生牛血清（不含10%在转染的前一天，消化293A细胞，用（这个地方可1.0抗生素）稀释细胞，在24孔细胞板上每孔接种营养液，每孔加20-30以灵活点，一般一瓶满的细胞消化后加孔细胞4h，把24520.8-1.2），、37℃饱和湿度下培养；在转染前室取出－20℃保存的转染试剂，板的营养液更换为新的营养液；200μL 37℃预热的无血在灭菌的玻璃瓶中先加入温融化并涡漩；3.0μL清培养基混匀后加入1.0μg的，（或不含血清的），然后加入1∶1）后立即涡漩，在室与质量/μg（使∶的体积/μL比为的
；从二氧化碳细胞培养箱中取出细胞板，～15 混合物l0温温育把混合物轻轻加入到细胞混合物，弃去上清；再一次短暂涡漩面上，注意不要直接吹到细胞面上，以免细胞脱落；轻轻混匀，然后立即把细胞板放入二氧化碳培使脂质体混合物覆盖细胞面，1.0 37℃预热的完全生长液（或后，轻轻加入养箱中；温育1.0h，把细胞放入二氧化碳培养箱，37℃培）使血清浓度降到2～6%。

14d养7～
2000对293细胞的毒性要稍微大一点，但是转染效率相对也高一点。

按照做就可以，记得一定在转染后4-6h换液。

加脂质体混天不换液，培养基不肯定是变黄了，但是细胞还10-14就可以传代。

转染后2d瓶，2天传代一次算是正常，我一般一瓶份2-3细胞
天后就会非常密的，此时看不到明显的细胞界限，这7部分是没有问题的，如果细胞不好，肯定是维持不到这个时间的。

细胞生长2-5%即可。

转染后4-6h换液可以用维持液，血清浓度在
法计算重组腺病毒的50。

重组腺病毒10倍比稀释（可以用维持液稀释，含2%血清）后接种293细胞，培养5d，观察，结果如下（表3-1）。

距离比=（高于50%的百分数-50%）/（高于50%的百分数-低于50%的百分）
=（83.350%）/（83.340%）
=0.77
+50%的病毒稀释度的对数50=高于距离比×稀释系数的对数×（－－7+0.771）=7.77
－=-8.77为10。

重组腺病毒的503-1重组腺病毒各稀释度的数表
3-1
当转染的细胞出现特征病变（局部细胞变圆、脱落，成网状）或细胞状态不足以维持时，将细胞连同细胞板一起放在-20度冰箱中冷冻，冻融后接种长满293A细胞的6孔细胞板，37℃吸附1.0h，每孔加入2.0维持液（含2%血清的），增殖病毒（反复冻融3次，取上清，不用过滤）。

先大量增殖病毒，然后按照每次试验的需血清保2%要量小量分装，测定病毒含量，病毒收获后可以添加．100-80℃保存，每次使用一管，完毕就处理掉，如每支存，最好微升，即使使用5微升，下次也不再使用。

在最佳的缓冲液（10 年稳定性。

2, 4% ）病毒会持续1-2 8.0, 2
，细胞病变效应出现后，基本就能确定腺病毒包装成功。

但还( )是要做鉴定，收毒后做免疫荧光，等。

病毒滴度测定、7,组织细胞感染量又称，50 50，半数组织培养感染剂量，50%即指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细腺病毒感染性滴度，反映的是单位体积中的病毒量。

胞病变( , )的病毒量。

50 ①准备细胞个细胞（一个～取出一块细胞培养板，每个孔大约传800010000。

T25瓶的细胞消化后加10培养液正好传一块孔板，要传匀）96％丰度即可接种病毒（下午传好板第二天60每个孔的细胞大约早上就能用）。

个孔即可。

滴定与对照可以在一块培养板上进细胞对照选取16也可以分别在不同的细
胞培养板上进操作中注意不要窜孔。

行，行，但要保证实验条件一致。

②稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法法参照书将液体量减少后的结果B无论哪种都无病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，
血清。

病0.2病毒稀释液。

向向每支试管中加入1.81号试管中加入A 10倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。

毒，依次，(10-1在管中用无血清的孵育液B10倍倍比稀释病毒原液，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。

首次滴-102…10等)10- 定可以多稀释几个滴度。

则每个稀常规每个稀释度接种4孔，根据接种的孔数稀释病毒，的孵育液中；如每个稀加入450μl10-1释度配500μl，即为50μl孵育10-18释度接种个孔，则各配制1，即为100μl加入900μl个孔，则相应增加液体量。

上述的配液并不是固液中。

若接种8 定不变的，可以根据接种的量自行调整。

此步操作注意事项：161）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至个孔。

2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。

乙醇擦拭加样3）此过程中需要使用加样器和头。

使用前用75%，确保无菌。

使用新高压的头，外包装器，并用紫外线照射20 一定在超净台（或安全柜中打开）。

③接种孔板中的培取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96然后吸出孵育液吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，养液，。

将稀释（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）．
100μl，根据观察的习惯，一般好的病毒液加到96孔板上，每孔）
到，10-2 从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（10-1 原液加样。

（切记：设置正常的细胞对照），取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高37℃2培养箱中孵育1h培养箱浓度吸取可避免窜孔）37℃2，加入维持液200μl继续在中培养。

（也有地方介绍不去掉病毒液）④培养（一般，培养几天。

4-5d）2将培养板放置于培养箱。

培养温度
⑤测定结果取出培养板，显微镜下观察细胞病变。

计算方法1) 法（常用）找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按公式观察,。

计算出该病毒液的5010-4~10-550%由表看出，能使细胞管出现病变的病毒稀释度在之间，其中间距离比例按和公式计算：病变的病毒最高稀释度的对数＋距离比例50＝高于50%104-550为10-4-5故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为，即，作其他一1倍稀释时，0.1中含个50104-5倍，当病毒悬液做100 50/0.1。

，一般常用些实验时（如中和试验）判定标准2)
细胞对照无病变，在无标准品时，应增加实验次数以减少误差。

因为在我们转线性化过的腺病毒是只要转进细胞就能表达荧光，腺病毒虽然是转染次日就会看到有少量荧光的表达。

染过程中，线性的，但是表达原件是完整的，所以荧光是表达的。

接毒还是可以的，病毒滴度很高的话，可以再低六孔板按照5%，比较容易做。

一点，但是由于没有测滴度，可以使用这个量。

如果50%可以在病变达到左右进行提取，这个好像要求不严格。

如果很少细胞脱落，大量细胞脱落，就要低速离心沉淀细胞再提。

去掉上请后，直接加裂解即可。

100%2、，你可以做一个时间梯度。

比如病变80%、、30%、50%。

按照病毒生长周期，蛋白应该在的时候取细胞，裂解后做和晚后期表达。

但是，由于接种量的关系，开始并不是每个细胞都释放出病毒后再感染其他细胞，一些细胞感染之后，感染了病毒。

这样，整个过程都在发生病毒的增殖周期。

所以，我看文献讲，保证每个细胞都感染上病毒；一开始，做鉴定，一般感染量要大，而做病毒增殖，感染量要低。

直接取上清或者一点细胞，量可能有点小。

最好做一下浓缩。

检测低限与蛋白量、一抗质量、检测方法有一定关系。

可以如果你的条件达不到，般离心可以起到浓缩和纯化的作用。

．我以前做动不做。

但是要保证你的病毒原始滴度可以用于试验。

物试验，测定免疫效果，也没有离心。

转染条件看你使用的转染试剂的要求，不同的转染试剂要求不都基本可以。

都有。

一般的80-90%60%同，从到95%
腺病毒纯化包括3步：
1．不连续氯化铯密度梯度离心去除主要的细胞污染物和缺陷性病毒颗粒。

2．连续氯化铯密度梯度离心将感染性病毒颗粒和缺陷性病毒颗粒分开。

3．透析去除氯化铯（去盐）。

连续密度梯度需要过夜离心。

为保证时间安排，建议从早上开始第1步，这样大约在午后就可开始过夜离心。

按照此时间安排，完整的一个纯化过程包括去盐在内大约需2天时间。

下面所有操作均以28转子30离心管为例。

理论上讲，溶液体积调整后也可用其它大小的离心管，切记在离心后收集病毒带。

由于有些污染物和成熟的病毒颗粒密度相近，因此这二条带之间的距离很小。

在大直径的离心管中，病毒带更细，离原始位置更远，这样，病毒带在30离心管中比在12的管中更易分辨。

5.5.7 不连续密度梯度离心
注意：为确保氯化铯密度梯度后较易分辨病毒带，扩增细胞。

108×3病毒至少需要．
1．预冷离心转子至4℃。

2．在离心管中缓慢加入8 1.4氯化铯（5387 10 ，7.9），再非常轻缓地加入6 1.2氯化铯26.8+9210 ，7.9）。

病毒最终的纯度有赖于密度梯度的质量。

3．超净台中在不连续梯度顶部加入20 5%病毒保存液，病毒量必须少于109细胞中所得的，否则将超过密度梯度负荷量。

如果保存液的体积少于20，用7.9 10 调至20。

4．平衡离心管，100000×g（28转子上为23000）4℃离心90分钟。

5．超净台中取出离心管，用夹子直立固定离心管。

6．用10移液器从梯度顶部吸去大部分杂质。

7．在离心管外壁的穿刺点上贴上胶带，以防止在穿刺过程中有液体泄露。

8．用带18G针头的5注射器从离心管外壁稍低于病毒带（最下的一条带）的位置进行穿刺。

注意：感染性和缺陷性病毒颗粒之间的区域通常较浑浊，切勿吸取这一浑浊区。

9．小心抽吸病毒带，避免吸到其它带和杂质，拔出针头。

10．取出针头，将含病毒的溶液转移至无菌15离心管。

11．加入1倍体积1×，这一步对于把溶液密度降低至1.2以下是必须的，病毒带的密度大约
为1.345。

5.7.2 连续密度梯度离心
1．使用连续密度发生器将12 1.4和14 1.2氯化铯连续密度梯度加入离心管中。

．
2．非常缓慢地在密度梯度顶部加入8-10 5.7.1第11步中稀释的病毒悬液。

3．100000×g 4℃离心16-20小时。

4．超速离心后，连续梯度溶液和不连续梯度溶液同样分层，但底部没有沉淀，因此通过底部
穿刺即可获得感染性病毒带。

溶液上部（含细胞成分）通常更为干净，大部分细胞碎片已通过第一步不连续梯度离心被去除了。

5．用10移液器从离心管顶部吸去大部分梯度溶液和杂质，避免吸到底部含病毒的蓝白色条带。

这有助于在收集病毒时降低溶液流出速度。

6．用20 G针头从底部穿刺收集底部蓝白色病毒带。

7．让底部梯度溶液流入烧杯，当接近病毒带时再转入50离心管中收集。

8．蓝白色病毒带收集完后再将剩余的梯度溶液转入烧杯。

说明：当然，病毒带也可以象不连续梯度时一样从侧壁穿刺收集。

5.7.3 病毒溶液去盐和浓缩
氯化铯是通过透析去除的，这一步至关重要，因为高浓度氯化铯可能会影响病毒对细胞或组织的感染。

透析液的选择取决于病毒的最终用途。

如果用于动物，则应避免使用甘油，因为含有甘油
的溶液极难注射；如果要使病毒滴度达到5×1011，则应避免5%蔗糖缓冲液，因其不能提供良好的病毒稳定性，由于溶液的关系，病毒将会沉淀下来。

含10 （8.0），2 2，5%蔗糖的病毒缓冲液可允许病毒浓缩至1013，并且具有良好的稳定性。

（等，道尔顿的纤维素酯25000将病毒带在分子筛为。

）1999．
由于病毒分子量较大，℃透析，去除氯化铯盐。

膜中进行4
，因此不能穿过透析膜。

缓冲液的体积应为病90大小约
3倍，每次透析一小时，然后更换缓冲液，毒溶液的200次更换缓冲液后应已无痕量氯化铯。

透析后的病毒溶液℃中则可保存较短时间。

需可在-80℃中长期保存，-20要注意的是腺病毒在
反复冻融后感染力将减弱，因此可：病毒滴将病毒分装成小份，一部分进行滴度测定（5.8，剩下的用于以后的实验。

如果透析后病毒溶液度测定）倍。

这个太稀，公司的超纯浓集柱可将病毒浓度提高10。

纯化柱在使用前必须10%过程中所丢失的病毒量小于（比然后在加入病毒前再去除痕量乙醇乙醇消毒，用70% 。

如用病毒缓冲液）．。