第7章 分批发酵、补料分批发酵与高密度发酵讲解

典型的分批发酵工艺流程图
1) 主要设备 主培养罐 (主发酵罐) 和种子培养罐(种子罐), 均属于深层培养装置。(含有配料, 蒸气灭菌, 冷却, 通 气, 空气过虑, 搅拌和消泡装置等)。种子罐: 为主发酵罐培养基接种所需要的菌体种子。 摇瓶培养 ---- 种子培养 ---- 发酵培养 (10倍体积逐级扩大)
分批发酵中细胞浓度的变化 1. 延迟期；2. 对数生长期；3. 减速期； 4. 稳定期；5. 衰退期
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
① 延迟期或延滞期
发酵培养基在接种后，一段时间内细胞浓度的增加不明显，该阶段为延迟期。新环境中存在某些旧环境中没有的营养
物质，细胞须合成有关酶类来利用该营养物质，从而出现延迟期。许多胞内酶需要辅酶或活化剂，它们是一些小分子物质
dX X dt
比生长速率μ与细胞种类、培养温度、pH、培养基组成成分和限制性基质浓度等因素有关。在对数生长期内， 细胞的生长不受限制，比生长速率达到最大值μm，
dX m X dt
如在 t1 时的菌体细胞浓度为X1，则在 t2 时的细胞浓度为： X2 =X1 exp［μm(t2 – t1)］ 所以，在对数生长期，细胞浓度随时间指数增长，细胞浓度增长一倍所需的时间称为倍增时间 (doub1ing time，td)。根据式上式可得倍增时间的计算公式：
第七章 分批发酵、补料分批发酵和高密度发酵
一. 分批发酵 (batch fermentation) 1. 分批发酵概况操作工艺 2. 分批发酵中的菌体生长规律、代谢变化 3. 分批发酵过程的最优化、生产率 二. 补料分批发酵（Fed-batch Fermentation） 1．补料分批发酵技术含义及二者区别 2．补料分批发酵技术特点和类型： 3．补料分批发酵的适用范围 4. 流加物料的方式和补料分批发酵的技术评价
2) 发酵生产基本过程 种子罐高压蒸气灭菌(空消) ------ 投入培养基再灭菌(实消) ------接入从摇瓶培养得来的种子 ------培养。 同时, 准备发酵罐 ------ 空消------ 连消: 利用专门的灭菌装置对发酵培养基进行连续灭菌------投入空消过 的发酵罐。经培养种子罐内达到一定菌体量时-----发酵罐 ------ 发酵终点 ------ 提取精制。 发酵周期: 每批反应的全过程即加入灭菌的培养基, 接种, 培养的诱导期, 反应过程, 放罐, 洗罐以及空
10 -100mg / L时,微生物就会以接近最大比生长速率 (μmax )的速度生长) c. 过高的底物浓度会造成一系列不利影响, 底物抑制, 培养基粘度升高引起传质效率降低等。克服 此不足的方法就是采用Fed-Batch法(补料分批技术)
一. 分批发酵 1. 分批操作工艺
分批发酵目的产物种类虽然不同, 但操作工艺基本相同. (见下图)
延迟期的长短与种子的菌龄及接种量的大小有关。年轻的种子产生的延迟期较短，接种量愈大，则延迟期愈短，生产 实践中缩短延迟期的方法主要有：加大接种量；在新的培养基中加入上次培养基的某些成分。
② 对数生长期 延迟期末，由于培养基中的营养物质比较充足，目标产物尚未开始积累或积累的很少，有害代谢物亦很少，所以 细胞的生长不受到限制，细胞浓度随培养时间呈对数增长，称为对数生长期，也称为指数生长期。 初始接种量越大，即：培养液中的细胞浓度愈大，细胞浓度的增长速率也就愈大。所以，菌体细胞浓度的变化率与 细胞浓度成正比：
三 高密度发酵（High cell-density fermentation）
1. 高密度发酵的定义、生产影响因素、策略以及反应器： 2. 重组大肠杆菌高密度发酵、
3. 除去抑制物的方法和存在的问题
分批发酵是指生物反应器的间歇操作, 在发酵过程中,除了不断进行通气(好氧发酵)和为调节发酵液 的pH而加入酸碱溶液外, 与外界没有其它物料交换。这种培养方式操作简单, 是一种最为广泛使用的方 式。分批发酵的主要特征是所有工艺变量都随时间而变化。主要的工艺变量是各种物质的浓度及其变化 速率。(见下表)

m S
Ks S
当限制性基质浓度很低时，增加该基质浓度可明显提高细胞的比生长速率，但若该基质浓度与Ks相比已相当高时，再 增大其浓度就不能明显地增加细胞的比生长速率。这时，细胞的比生长速率接近“饱和”。 在培养动植物细胞和微生物细胞生产代谢产物时，产物的最大生产速率往往是在生长受到抑制的情况下得到的。采用 适当的限制性基质限制细胞生长，有时会有利于产物的积累。如：酵母菌Y33::YFD71-3是一株腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸缺 陷的基因工程菌. 在进行摇瓶培养时，菌体生长受腺嘌呤限制时菌体分泌的蛋白明显增加，而菌体生长受亮氨酸限制时，蛋白的生产受 到影响。如下表所示。这是因为生长受到腺嘌呤的限制时，过量存在的氨基酸可用于蛋白质合成，而生长受亮氨酸限制时， 蛋白质的合成也受到了限制。
罐灭菌所需要时间的总合。
2. 分批发酵中的菌体生长规律 微生物的生长包含两个含义 即：细胞的生长 微生物群体数量的增加 1) 典型的生长周期 分批培养是一个封闭的系统。接种后, 除氧之外, 一 般都不向系统内添加和除去任何物质。因此, 分批培 养系统只能在一段时间内支持微生物的增殖。可以分 为五个时期: A 延迟期 B 对数生长期 C 减速期 D 静止期 E 衰退期
或离子，具有较大的通过细胞膜的能力。当细胞转移到新环境中，这些物质可因扩散作用而从细胞中向外流失，这是产生 延迟期的又一原因。 如：产气气杆菌在葡萄糖磷酸缓冲液中的延迟期与镁离子浓度有关，当培养基中镁离子浓度较高时，细胞内镁的流失
少，延迟期较短；而当培养基中镁离子浓度低时，由于镁的流失而使延迟期大大延长。
微生物工艺中的变量及其变化速率
rx
分批发酵的思考 在分批发酵中, 低浓度培养基中的营养物会迅速耗尽, 引起培养物过早地从指数生长期向稳 定期转变。
提高底物浓度的优点与不足: a. 提高底物浓度可以延长微生物的指数生长期, 从而提高发酵的容量产率和产物浓度 。 b. 提高底物浓度(对于某些可溶性碳源来说, 微生物的 Ks 值多在1- 10mg/ L范围内,当超过10 Ks或
td
ln 2
m

0.693
m
微生物细胞的倍增时间较短。细菌一般为0.25～1小时，酵母菌约为1.15～2小时，霉菌约为2～6.9小时。 动植物细胞的倍增时间较长，如哺乳动物细胞的td一般为15～100小时，植物细胞约为24～74小时。
③ 减速期 随着细胞的大量繁殖，培养基中的营养物质迅速消耗，目的产物开始大量积累的同时，有害代谢物亦逐渐积累， 细胞的生长速率逐渐下降，进入减速期。当培养液中不存在抑制细胞生长的物质时，细胞的比生长速率和限制性基质浓度S 的关系可用Monod方程来表示：