【生物课件】 免疫组化基本技术
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免疫组化技术课件
隔水热抗原修复法：
①切片脱蜡至水。
②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。
③自来水洗，蒸馏水洗。
④切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）中，
边同容器一起放入水锅中加热，其间应不断用温
度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温
度后（92℃↑）。即开始计时，持续40分钟。 ⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后 按选定好的免疫组化染色方法进行染色。
② 间接法
间接法也称夹心法，是将酶标记在第二抗 体上（第二抗体为抗第一抗体的抗体）， 形成抗原-第一抗体-第二抗体-HRP复合物， 然后进行显色。该法要求第二抗体与第一 抗体应是不同种属的动物产物。间接法应 用广泛，只需标记一种二抗就可以检测众 多相同种属来源的一抗。
免疫组化SP法的基本步骤
（1）石蜡切片脱蜡至水。 （2）抗原修复 （3）3% H2O2室温孵育5~10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。 （4）蒸馏水冲洗，PBS洗。 （5）5%~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min。倾去 血清，勿洗，滴加适当比例稀释的第一抗体或即用型第一抗体，37℃孵育 2h或4℃过夜。 （6）PBS冲洗，5min×3次。 （7）滴加适当比例稀释的二抗，37℃或室温孵育10~30min。 （8）PBS冲洗，5min×3次。 （9）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释）或辣根酶标记 链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30min。 （10）PBS冲洗，5min×3次。 （11）显色剂显色（DAB或AEC）。 （12）自来水充分冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，苏木精复染，中性树 胶封片。
荧 光： 在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发 出较激发光波长更长的可见光并随照射停止而消失 荧光显微镜： 荧光显微镜的光源提供各种激发光，如 紫外光、蓝紫光（有不同的波长范围）， 使受检标本内的荧光物质发出发射光
免疫组化理论课 ppt课件
医学资源 9
多抗和单抗的比较
均一性，单抗的均一性很强 稳定性，单抗的稳定性较差 特异性，单抗的特异性强 重复性，单抗的重复性好
医学资源
10
主要有两大类： 1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异
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加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅 度地提高，其机理推测可能是加热打开 了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗 原决定簇的交联，但机理目前仍然还不 是十分清楚。
医学资源
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医学资源
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医学资源
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4.抗原修复液的选择
加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液 （pH6.0）, Tris (pH7-8) , EDTA(pH8.0)等, 目前 首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背 景清晰，适合于大多数抗体,Tris和 EDTA两种修 复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同 时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。
医学资源
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1、微波修复
本实验室微波修复应用最多，特点是简单、有效， 主要根据微波发射高频能量，组织经微波幅射后， 会加速组织内部分子高速运动，抗原可完全被暴 露出来，用于浆或部分核抗原，膜抗原不用或短 时间应用。在 0.01M PH6.0 柠檬酸缓冲液 微波 修复时，温度控制在95-100℃之间维持10分钟， 不足或超过100℃达不到抗原修复最佳效果。
医学资源 20
胰蛋白酶，用于胞浆抗原，此酶较温和，浓
度 及 消 化 时 间 易 控 制 ， 常 用 0.05%~0.1%, PH7.8, 37℃消化20~30′ 或更长，微波37℃ 可短时消化。 胃蛋白酶，用于间质抗原，常用0.2% PH2.5 左右，消化 20~30′ 或更长，消化后切片应充 分洗涤，否则对组织中抗原会进行缓慢消化， 破坏组织结构
多抗和单抗的比较
均一性，单抗的均一性很强 稳定性，单抗的稳定性较差 特异性，单抗的特异性强 重复性，单抗的重复性好
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主要有两大类： 1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异
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加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅 度地提高，其机理推测可能是加热打开 了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗 原决定簇的交联，但机理目前仍然还不 是十分清楚。
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4.抗原修复液的选择
加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液 （pH6.0）, Tris (pH7-8) , EDTA(pH8.0)等, 目前 首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背 景清晰，适合于大多数抗体,Tris和 EDTA两种修 复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同 时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。
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1、微波修复
本实验室微波修复应用最多，特点是简单、有效， 主要根据微波发射高频能量，组织经微波幅射后， 会加速组织内部分子高速运动，抗原可完全被暴 露出来，用于浆或部分核抗原，膜抗原不用或短 时间应用。在 0.01M PH6.0 柠檬酸缓冲液 微波 修复时，温度控制在95-100℃之间维持10分钟， 不足或超过100℃达不到抗原修复最佳效果。
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胰蛋白酶，用于胞浆抗原，此酶较温和，浓
度 及 消 化 时 间 易 控 制 ， 常 用 0.05%~0.1%, PH7.8, 37℃消化20~30′ 或更长，微波37℃ 可短时消化。 胃蛋白酶，用于间质抗原，常用0.2% PH2.5 左右，消化 20~30′ 或更长，消化后切片应充 分洗涤，否则对组织中抗原会进行缓慢消化， 破坏组织结构
《免疫组织化学技术》PPT课件
PTP课件
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双桥PAP法原理
• 该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥 抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比 PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合 物中的HRP催化底物显色。
PTP课件
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双桥PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）、（4）和（5）同 PAP法。
PTP课件
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PAP法的原理
PTP课件
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PAP法技术要点
• （1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 • （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-
Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. • （6）加底物，光镜下观察显色结果。
PTP课件
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PAP法的方法评价
• PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性 的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。 PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组 成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲 洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋 白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏 感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色 法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过 程较复杂。
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免疫组化技术要点
• 标本的制作 • 抗体的选择 • 温育 • 改善标本的透过性 • 设立对照试验 • 免疫组化的结果判断
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标本的制作
• 标本的类型
1.组织切片：①冷冻切片；②石蜡切片 2.印片 3.涂片
• 标本的固定 • 标本的保存 • 酶消化处理
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设立对照试验
• （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2PAP-Ab2复合物，洗涤。
免疫组化技术实用篇教学课件
2023免疫组化技术实用篇教学课件pptcontents •免疫组化技术简介•免疫组化技术实验流程•免疫组化技术实验数据分析和解读•免疫组化技术实验优化和提升•免疫组化技术前沿进展和发展趋势目录01免疫组化技术简介免疫组化技术是一种用于研究生物组织中蛋白质表达和分布的生物学技术。
定义免疫组化技术分为直接法和间接法两大类，其中间接法应用最为广泛。
分类定义与分类直接法利用特异性抗体直接与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
间接法利用特异性抗体与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
免疫组化技术的原理1免疫组化技术的应用23免疫组化技术可用于疾病诊断，如癌症、自身免疫性疾病等。
疾病诊断免疫组化技术可用于科学研究，如在细胞和分子水平上研究生物大分子的相互作用和功能。
科学研究免疫组化技术可用于药物研发，如检测药物在组织中的分布和作用。
药物研发02免疫组化技术实验流程包括组织样本、抗体、抗原等；实验准备实验材料准备如显微镜、染色机等；实验仪器准备熟悉实验操作流程和注意事项。
实验操作准备切片制作将组织样本制作成切片，并进行脱蜡、水化等处理；加一抗将抗体稀释后加入切片中，孵育适宜时间；抗原修复使用抗原修复液对切片进行修复，以暴露出抗原；加二抗将标记有荧光素的二抗加入切片中，孵育适宜时间；阻断加入阻断液，以抑制内源性过氧化物酶活性；观察与拍照用荧光显微镜观察染色结果，并进行拍照记录。
实验步骤及操作流程实验注意事项实验前务必熟悉操作流程和注意事项；对于不同的组织类型和抗体，应根据具体情况调整实验条件和操作步骤；实验过程中要注意安全，避免受伤和感染；在实验过程中要保持实验室的清洁和整洁，遵守实验室规范。
03免疫组化技术实验数据分析和解读03定量PCR使用荧光定量PCR技术，检测样本中特定基因的表达水平，分析免疫组化染色的结果。
免疫组化技术ppt课件
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗 体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋 巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合 杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体 是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从 动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋 巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原， 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、 受体、酶、激素、核酸及病原体等都可 用相应的特异性抗体进检测。
7、SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）， 由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光） （1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保 存。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 • 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避 光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂） 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％ H2O2。 • PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 • 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液 （pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至 沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间 隔补足液体，防止干片
4、封闭非特异性蛋白 • PBS溶液洗3次×3 min； • 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周 围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源 一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 • 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清， 直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后， 放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出 需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 • 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； • 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放 入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 • 用PBS洗5次×5 min；
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原， 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、 受体、酶、激素、核酸及病原体等都可 用相应的特异性抗体进检测。
7、SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）， 由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光） （1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保 存。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 • 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避 光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂） 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％ H2O2。 • PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 • 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液 （pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至 沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间 隔补足液体，防止干片
4、封闭非特异性蛋白 • PBS溶液洗3次×3 min； • 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周 围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源 一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 • 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清， 直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后， 放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出 需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 • 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； • 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放 入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 • 用PBS洗5次×5 min；
《免疫组化技术》课件
特点
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
免疫组化技术课件课件精选课件
色
色
阳性细胞的染色特征：
①阳性细胞的染色分布有三种： 胞浆；细胞核；细胞膜表面
②阳性细胞分布：灶性；弥漫性
③染色强度不一
④切片边缘，刀痕or组织折叠，坏死，挤压区， 胶原结缔组织等常表现为相同的阳性染色强度。
对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计
第二十六页，本课件共有45页
第三十七页，本课件共有45页
免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则： ①免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HE染色的
形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把 免疫组化染色作为诊断的“金标准”。
②免疫组化对良、恶性的判断仅供参考。
③免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。
④免疫组化染色不好或出现相互矛盾的结果时，以形态学为 准。
第四页，本课件共有45页
显示物： ➢酶标反应：
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase,AP）
AP与不同的底物（萘酚As-Mx、快蓝、快红）作用， 可形成不同颜色的终产物。用新品红（New fuchsine） 显色，可形成不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。
②辣根过氧化酶(Horseradise peroaidase,) HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色 沉淀，不溶于有机溶剂，不褪色。
前列腺特异性抗原（PSA）： 甲胎蛋白（AFP）：
甲状腺球蛋白（Tg）：
第三十页，本课件共有45页
软组织标记
软组织：全身各处的纤维结缔组织，脂肪组织，
肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。
肌动蛋白（Actin）：分布于所有的肌型细胞中
肌红蛋白（Myoglobin）：是骨骼肌肌浆中的一种
免疫组化 ppt课件
（2）细胞固定 离心→涂片→固定5到10分钟→漂洗→组化
（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片不需此步骤。
1、包埋
定义：脱水透明后，用石蜡、火棉胶、 环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变 硬（利于切片）的过程。石蜡包埋适于 绝大多数组织学和组化技术。
2、常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
(二) 内源性酶的消除方法
1、内源性过氧化物酶的消除方法 1） 0.3～3% H2O2甲醇溶液浸泡20min 2） 3％ H2O2溶液浸泡20min
2、内源性碱性磷酸酶的消除方法
左旋咪唑 （24mg/ml）加入底物液 中,并保持pH7.6-8.2。
（三）抗原修复
1、目的 暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期 formalin固定的标本、石蜡包埋标本。
2、修复液 10mM，pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液
3、常用的修复方法有
1） 微波加热 2） 高压锅处理 3） 酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶(含0.1%
CaCl2，pH7.8)，37℃ 10min(细胞内抗原)或 0.4%胃 蛋白酶，37℃ 30min以上(细胞间抗原)。
（四）封闭
采用正常二抗来源的动物血清封闭，以 减少一抗非特异性结合。
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
直接法特点：1、此法特异性高，但敏感性低； 2、每种抗体均需单独标记，使用不便。
间接法特点： 1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异 性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动 物的二抗。
常用的免疫组化方法
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 （avidin-biotin-peroxidase complex technique， 简称ABC法）。
（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片不需此步骤。
1、包埋
定义：脱水透明后，用石蜡、火棉胶、 环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变 硬（利于切片）的过程。石蜡包埋适于 绝大多数组织学和组化技术。
2、常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
(二) 内源性酶的消除方法
1、内源性过氧化物酶的消除方法 1） 0.3～3% H2O2甲醇溶液浸泡20min 2） 3％ H2O2溶液浸泡20min
2、内源性碱性磷酸酶的消除方法
左旋咪唑 （24mg/ml）加入底物液 中,并保持pH7.6-8.2。
（三）抗原修复
1、目的 暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期 formalin固定的标本、石蜡包埋标本。
2、修复液 10mM，pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液
3、常用的修复方法有
1） 微波加热 2） 高压锅处理 3） 酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶(含0.1%
CaCl2，pH7.8)，37℃ 10min(细胞内抗原)或 0.4%胃 蛋白酶，37℃ 30min以上(细胞间抗原)。
（四）封闭
采用正常二抗来源的动物血清封闭，以 减少一抗非特异性结合。
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
直接法特点：1、此法特异性高，但敏感性低； 2、每种抗体均需单独标记，使用不便。
间接法特点： 1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异 性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动 物的二抗。
常用的免疫组化方法
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 （avidin-biotin-peroxidase complex technique， 简称ABC法）。
免疫组化实验方法ppt课件
非特异吸附，常用牛血清白蛋白 （5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入
适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐 （6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应，
低温有利于抗原抗体结合率的提高 （7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。
选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片）
• 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂 片）。
• 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连 续切片，有利于各种染色对照观察；还能 长期存档；
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃ 冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。
（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景 非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验 摸索，找出最佳稀释度。
（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻 融次数。
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。
（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐 （6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应，
低温有利于抗原抗体结合率的提高 （7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。
选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片）
• 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂 片）。
• 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连 续切片，有利于各种染色对照观察；还能 长期存档；
3
火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃ 冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。
（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景 非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验 摸索，找出最佳稀释度。
（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻 融次数。
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。
（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）
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火灾袭来时要迅速疏散逃生，不可蜂 拥而出 或留恋 财物， 要当机 立断， 披上浸 湿的衣 服或裹 上湿毛 毯、湿 被褥勇 敢地冲 出去
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尤其是开展分子生物学工作。动物组织取 材要求心脏还在跳动时取材。
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2.注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。
3.组织块的大小 厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定
4.动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定
h
15
5.取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手
术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定 后取材。
优点：操作简单，抗原保存好 缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背
景染色。 2.穿刺吸取法
h
19
3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿 液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。
（1）常规细胞玻片制片法 （2）单核细胞分离法
h
20
体液沉渣细胞学切片制作：
1. 取两只10ml试管，分别装入体液10ml，离 心后留取沉渣。
饱和苦味酸 150ml
PB液至
1000ml
(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛
固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，
对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
h
30
(7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加 入2.5%重铬酸钾25ml。
(8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿
h
22
3.制备细胞玻片应注意 （1）易脱片； （2）细胞应集中在直径0.6～
1.0cm的圆圈内，总数105-106； （3）富于粘液的标本，未经处理
不宜做IHC。
h
23
4.活细胞标本的制备法
培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁
细胞可将
（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成
悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，
h
16
6.注意包埋方向 7.边缘标记 8.保持材料的清洁 9.切除不需要的部分 10.明确编号，登记 11.骨组织还需脱钙
h
17
四、细胞材料的准备 细胞的取材和制片法：
1.印片法：常用于活检或手术切除标本。 将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻 压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。
h
18
展IHC检测的关键。
h
11
二、动物组织标本的取材 动物的处死方式一般为活杀，组织标
本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷 冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固 定后，再进行后固定。
h
12
动物处死方法：
1.麻醉法 乙醚或4％戊巴比妥静注
2.空气栓塞法
3.断头法
4.击头法
5.股动脉放血法
h
13
三、组织取材注意事项 1.组织要求离体后30min内浸入固定液，
h
8
2.各种小组织的活检取材： 它不仅体积小，取材困难，不易取到
主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重， 及时固定，包埋时要平整。
h
9
3.穿刺标本的取材： 光镜（HE、特殊染色、IHC、ISH） 电镜（透射电镜、免疫电镜）
h
10
4.尸检组织的取材
病人死亡后，一般要在数小时后才能
做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开
30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备 用，对核内抗原的保存效果较好。
h
31
(10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇
类固定剂其固定原理主要是对蛋白 质的沉淀而发生固定作用。
h
32
3.固定方法的选择及注意事项 (1)大小 2cm×2cm×0.3cm (2)及时固定
h
33
(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚 薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原 则上，组织块大小与固定时间成正比，固 定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。 (4)组织固定后必须彻底冲洗。
前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背
景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的
脱片。
h
6
一、人体组织标本的取材 手术切除标本，各种活检穿刺
标本和尸体解剖标本。
h
7
1.手术切除标本的取材： 抗原在组织中的分布常不均一，取材
时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交 界处，远离病灶的正常组织。 组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。
免疫组化基本技术
倪灿荣
h
1
RCA法 IS-PCR
UIP LSAB法 双PAP法 PAP法
IGSS CSA法 Envision
A法BC
桥法 间接法 直接法
h
2
第一部分 组织与细胞材料的制备
h
3
内容：组织与细胞材料 的取材和保存
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4
主要内容
一、人体组织标本的取材
二、动物组织标本的取材
三、取材注意事项
2. 滴入蛋清1～2滴混匀，加入固定液5ml，固 定1h，离心后留取沉渣。
3. 将试管剪开，底部1cm处，取出沉渣，用擦 镜纸包好，进行常规脱水、包埋、石蜡切 片。
4.
该方法可以免除大范围的阅片,又可避
免漏诊, 可重复切片, 使IHC标记更为方便。
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21
自动细胞离心涂片机制作胸腹水细 胞学涂片方法。
h
27
2.固定液的种类 (1)甲醛固定液 10％福尔马林 10％中性福尔马林 10％中性缓冲福尔马林
h
28
(2)4％多聚甲醛固定液
(3)Bouin S液及改良Bouin S液
5mg
氯化汞
10g
冰醋酸
50ml
蒸馏水
800ml
h
29
(5)Zamboni S液
多聚甲醛 20g
h
25
（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起 来而产生不同的折射率，造成光学 上的差异，以便染色后易于鉴别和 观察。
（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、 增加组织硬度、便于制片。
h
26
（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有形态结构。
（6）经过固定的组织能对染料产生 不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。
四、细胞标本的准备
五、组织的固定、脱水、透明和包埋
六、切片
七、组织与细胞材料的保存
h
5
概述
免疫组织化学（Immunohistochemistry;
IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备
优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，
稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或
标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC
凉干后固定。
（2）将细胞直接培养在盖玻片上。
（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经
固定后可行IHC。
h
24
五、组织标本的固定 1.目的 (1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶
和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 (2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等
各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它 原有的结构与生活时相仿。
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2.注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。
3.组织块的大小 厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定
4.动物和人体组织的取材位置 要视研究目的，观察部位而定
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5.取材时间 原则上，应尽快取材，但比较大的手
术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定 后取材。
优点：操作简单，抗原保存好 缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背
景染色。 2.穿刺吸取法
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3.沉淀法 主要用于胸水、腹水、尿 液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。
（1）常规细胞玻片制片法 （2）单核细胞分离法
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体液沉渣细胞学切片制作：
1. 取两只10ml试管，分别装入体液10ml，离 心后留取沉渣。
饱和苦味酸 150ml
PB液至
1000ml
(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛
固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，
对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
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(7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml，加 入2.5%重铬酸钾25ml。
(8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液 甲醇60ml，氯仿
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3.制备细胞玻片应注意 （1）易脱片； （2）细胞应集中在直径0.6～
1.0cm的圆圈内，总数105-106； （3）富于粘液的标本，未经处理
不宜做IHC。
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4.活细胞标本的制备法
培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁
细胞可将
（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成
悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，
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6.注意包埋方向 7.边缘标记 8.保持材料的清洁 9.切除不需要的部分 10.明确编号，登记 11.骨组织还需脱钙
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四、细胞材料的准备 细胞的取材和制片法：
1.印片法：常用于活检或手术切除标本。 将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻 压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。
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展IHC检测的关键。
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二、动物组织标本的取材 动物的处死方式一般为活杀，组织标
本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷 冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固 定后，再进行后固定。
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动物处死方法：
1.麻醉法 乙醚或4％戊巴比妥静注
2.空气栓塞法
3.断头法
4.击头法
5.股动脉放血法
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三、组织取材注意事项 1.组织要求离体后30min内浸入固定液，
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2.各种小组织的活检取材： 它不仅体积小，取材困难，不易取到
主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重， 及时固定，包埋时要平整。
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3.穿刺标本的取材： 光镜（HE、特殊染色、IHC、ISH） 电镜（透射电镜、免疫电镜）
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4.尸检组织的取材
病人死亡后，一般要在数小时后才能
做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开
30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备 用，对核内抗原的保存效果较好。
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(10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液 (13)丙酮及醇类固定剂 丙酮、乙醇
类固定剂其固定原理主要是对蛋白 质的沉淀而发生固定作用。
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3.固定方法的选择及注意事项 (1)大小 2cm×2cm×0.3cm (2)及时固定
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(3)固定时间 固定时间要视组织块的厚 薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原 则上，组织块大小与固定时间成正比，固 定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。 (4)组织固定后必须彻底冲洗。
前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背
景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的
脱片。
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一、人体组织标本的取材 手术切除标本，各种活检穿刺
标本和尸体解剖标本。
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1.手术切除标本的取材： 抗原在组织中的分布常不均一，取材
时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交 界处，远离病灶的正常组织。 组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。
免疫组化基本技术
倪灿荣
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RCA法 IS-PCR
UIP LSAB法 双PAP法 PAP法
IGSS CSA法 Envision
A法BC
桥法 间接法 直接法
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第一部分 组织与细胞材料的制备
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内容：组织与细胞材料 的取材和保存
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主要内容
一、人体组织标本的取材
二、动物组织标本的取材
三、取材注意事项
2. 滴入蛋清1～2滴混匀，加入固定液5ml，固 定1h，离心后留取沉渣。
3. 将试管剪开，底部1cm处，取出沉渣，用擦 镜纸包好，进行常规脱水、包埋、石蜡切 片。
4.
该方法可以免除大范围的阅片,又可避
免漏诊, 可重复切片, 使IHC标记更为方便。
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自动细胞离心涂片机制作胸腹水细 胞学涂片方法。
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2.固定液的种类 (1)甲醛固定液 10％福尔马林 10％中性福尔马林 10％中性缓冲福尔马林
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(2)4％多聚甲醛固定液
(3)Bouin S液及改良Bouin S液
5mg
氯化汞
10g
冰醋酸
50ml
蒸馏水
800ml
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(5)Zamboni S液
多聚甲醛 20g
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（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起 来而产生不同的折射率，造成光学 上的差异，以便染色后易于鉴别和 观察。
（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、 增加组织硬度、便于制片。
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（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失 去其原有形态结构。
（6）经过固定的组织能对染料产生 不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。
四、细胞标本的准备
五、组织的固定、脱水、透明和包埋
六、切片
七、组织与细胞材料的保存
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概述
免疫组织化学（Immunohistochemistry;
IHC） 技术是一门综合性技术，除了具备
优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，
稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或
标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC
凉干后固定。
（2）将细胞直接培养在盖玻片上。
（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经
固定后可行IHC。
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五、组织标本的固定 1.目的 (1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶
和腐败，以保持组织细胞的固有形态。 (2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等
各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它 原有的结构与生活时相仿。