第23章_三羧酸循环

3 、由异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸
3.1 反应方程式
3.2 反应机制
异柠檬酸为β-羟酸，辅助因子NAD+作为受氢体形成β-酮酸 即草酰琥珀酸位于异柠檬酸β-碳原子上的羟基转变为酮基。 酮基的形成促使了邻近C-C键的断裂，即有利于脱羧作用的 进行(β-裂解)。 ● β-裂解是生物化学中最常见的一种C-C键的断裂方式。
氧化型硫辛酰胺
第二步反应, 在二氢硫辛酰转乙酰基酶分子E2上结合着的乙酰基,由E2催化,将乙 酰基转移到CoA-SH分子上,形成游离的乙酰-CoA分子,从而使二氢硫辛酰转乙酰基 酶E2由氧化型变成还原型。
2.2.1 反应机制
该反应实际上是一个酰基转移反应，辅酶A的硫氢基进攻E2-乙 酰二氢硫辛酰胺上的乙酰基,先形成一个四面体的中间体,接着迅速 分解为乙酰-CoA和E2-二氢硫辛酰胺,在此形成的游离状态的乙酰 -CoA分子保留了高能的硫酯键(一个高能硫酯键)。
5. 琥珀酰CoA转化成琥珀酸，并产生一GTP
5.1 反应方程式
琥珀酰-CoA硫酯键是一个高能键，它的断裂与鸟苷二磷酸(GDP) 的磷酸化相偶联。
5.2 琥珀酰-CoA合成酶
(1). 琥珀酰-CoA合成酶(也称为称琥珀酰硫激酶)，其命名指的 是催化相反相反方向的反应，该反应极易向正反两方向进 行，但在柠檬酸循环中都是向形成琥珀酸的方向进行。 (2). TCA循环中唯一底物水平磷酸化直接产生高能磷酸化合物 的步骤，反应中形成的GTP在生物合成中有特殊的作用。 它参与信号的传递过程，还能通过琥珀酸-CoA合成酶和核 苷二磷酸激酶的偶联作用，使琥珀酸-CoA水解产生一 个ATP。
1 2 3
琥珀酸-CoA+GDP+Pi→琥珀酸+CoA+GTP
用R表示
E2的硫辛酰胺辅基
E2的赖氨酸残基
羟乙基–TPP‧E1
二氢硫辛酰转乙酰基酶的硫辛酰胺辅基 (lipoamide‧E2)
B:
乙酰二氢硫辛酰胺‧E2
TPP‧E1
2.2 乙酰基转移到CoA分子上形成乙酰－CoA（由E2完成）
辅酶A
还原型乙酰 硫辛酰胺 还原型 硫辛酰胺
乙酰辅酶A
丙酮酸
羟乙基-TPP
酶和磷酸酶作用。
三 、 柠 檬 酸 循 环 概 貌
乙酰CoA C2
柠檬酸 C6
草酰乙酸 C4
异柠檬酸 C6
苹果酸 C4
α-酮戊二酸 C5
延胡索酸 C4 琥珀酰CoA C4 琥珀酸 C4
四、柠檬酸循环的反应机制
1. 第1步反应: 草酰乙酸与乙酰-CoA缩合形成柠檬酸
1.2 反应机制
1 2
第一步：柠檬酸合酶的组氨酸(His)残基(1)作 为碱基与乙酰-CoA的甲基(2)作用,使
(1). α-酮戊二酸脱氢酶系与丙酮酸脱氢酶复合体极其 相似，由α-酮戊二酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酰转琥 珀酰酶(E2)、二氢硫辛酰脱氢酶(E3)组成。
●这里的E3与丙酮酸脱氢酶复合体的E3是一样的。而E1则与丙
酮酸脱氢酶复合体的E1不同，它不受磷酸化、去磷酸化共价 修饰调节。
(2). α-酮戊二酸脱氢酶受其产物琥珀酰-CoA、NADH 和高能荷的抑制。当细胞的ATP充裕时，柠檬酸循 环进行的速度便减慢。
丙酮酸的羰基进
解离的负碳离子向
攻,使形成丙酮酸与
丙酮酸 (其羰基碳带正性) 带有负碳离子的TPP
TPP的加成化合物。
以下用R表示
以下用R’表示
丙酮酸TPP加成化合物
B、丙酮酸－TPP加成物脱羧反应形成羟乙基-TPP
丙酮酸-TPP加成物脱羧,形成羟乙基-TPP，由于TPP环上带正电荷 的氮原子起电子“陷井”作用,使脱羧后形成的羟乙基上产生较稳定的 负碳离子。
2.4、还原型的E3再氧化
还原型E3二硫键的再氧化先由该酶的辅基FAD接受一 SH基的氢原子,形成FADH2,其后将氢原子转移给NAD+, 于是恢复其氧化型。
总反应式可表示为:
丙酮酸+CoASH+NAD+
乙酰CoA+CO2 + NADH + H+
3. 丙酮酸脱氢酶复合体的调控
由于丙酮酸既可走向提供能量的分解途径,又可走向生物合成 途径，故受到严密的调节控制： 1、产物抑制： 受乙酰CoA和NADH的控制。乙酰CoA抑制转 乙酰基酶E2组分，NADH抑制二氢硫辛酰脱氢酶E3组分。抑 制效应被CoA和NAD+逆转。 2、磷酸化和去磷酸化作用的调节：丙酮酸脱氢酶组分E1的 磷酸化状态无活性，反之有活性, 其磷酸化受E2上结合的激
(3). 异柠檬酸的转变有两条途径：一是当需要能量时，进行氧化
4. α-酮戊二酸氧化脱羧成为琥珀酰-CoA
4.1 反应方程式
4.2 反应机制
α-酮戊二酸脱氢酶系催化的每步机制和丙酮酸脱 氢酶复合体相一致，需要TPP、硫辛酸、CoA、FAD、NA D+、Mg2+6种辅助因子。
4.3 α-酮戊二酸脱氢酶系
Chapter 23.
柠檬酸循环
绪论:
在无氧条件下，葡萄糖经分解代谢形成丙酮酸，丙酮 酸继续形成乳酸或乙醇。在有氧条件下，丙酮酸可继续进 行有氧分解，最后完全氧化，形成CO2和水。此途径分为 柠檬酸循环和氧化磷酸化两个阶段。
定义：在有氧条件下，葡萄糖酵解产生的丙酮酸氧化脱羧形成
乙酰CoA。乙酰CoA经一系列氧化、脱羧，最终生成CO2 和H2O并产生能量的过程，称为柠檬酸循环，由于柠檬 酸含三个羧基，所以亦称为三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA 循环) 。由于它是由H.A.Krebs(德国)正 式提出的，故又称Krebs循环。
(2).
1.1 大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体的内容
缩写 肽链数
24
辅基
TPP
催化反应
丙酮酸 氧化脱羧
将乙酰基 转移到CoA 将还原型硫辛酰胺 转变为氧化型
丙酮酸 脱氢酶
二氢硫辛酰 转乙酰基酶 二氢硫辛 酸脱氢酶
E1
E2
24
硫辛酰胺 NAD+ FAD
E3
12
2. 催化丙酮酸转变为乙酰－CoA的反应步骤
合体(丙酮酸脱氢酶系)催化。
E3
E1
1. 丙酮酸脱氢酶复合体
(1).
E2
丙酮酸脱氢酶复合体是一个十分复杂的多酶复 合体，包括丙酮酸脱氢酶组分E1、二氢硫辛 酰转乙酰基酶E2、二氢硫辛酸脱氢酶E3。 参加反应的还有焦磷酸硫胺素(TPP)、硫辛酰胺， FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸),NAD+,CoA-SH及Mg2+ 六种辅助因子组装而成。
(经过一个四 面体中间物)
(acety1-dibydro lipoamide ‧E2)
乙酰二氢硫辛酰胺‧E2
乙酰-CoA (acety1-CoA)
E2酶和辅基二氢硫辛酰胺
(dihydrolipoamide‧E2)
2.3 还原型二氢硫辛酰转乙酰基酶E2氧化,由还原型变成 氧化型（由E3完成）
辅酶A
还原型乙酰 硫辛酰胺 还原型 硫辛酰胺
●肌肉组织悬浮液中加入少量草酰乙酸或苹果酸等4C二羧酸，则氧 利用量远超过加入的二羧酸氧化为CO2和水所需要的氧分子。
(3). Carl Martius和Franz Knoop发现:
●柠檬酸通过顺-乌头酸被异化为异柠檬酸，然后再氧化脱羧形成α-酮 戊二酸， α-酮戊二酸经氧化形成琥珀酸。
三羧酸循环在线粒体基质中进行。
TCA循环是糖、脂肪、蛋白质和氨基酸等氧化所共同经历的途径。 同时，TCA循环生成的中间物也是许多生物合成的前体。因此TCA循 环是两用代谢途径。
多糖 葡萄糖 脂肪 甘油 脂肪酸 蛋白质 氨基酸
第二阶段
(释能1/3)
柠檬酸循环
一.柠檬酸循环的发现历史
从1932年至1936年，Krebs H A 和其它几位科学家 共同 研究，最后由Krebs 提出完整的柠檬酸循环途径。于 1953年获 得诺贝尔奖。
2.1丙酮酸脫羧反应（丙酮酸变成乙酰基）
辅酶A
还原型乙酰 硫辛酰胺 还原型 硫辛酰胺
乙酰辅酶A
丙酮酸
羟乙基-TPP
氧化型硫辛酰胺
这是第一步反应,由丙酮酸脱氢酶E1(以TPP為辅基)催化,可划分为两个步骤。
(1) 羟乙基-TPP的形成
A、丙酮酸-TPP加成化合物的形成
具很强酸性, 易形成负碳离子
H+
(1). Krebs H A发现:
●肌肉、肾脏、肝脏等组织的匀浆悬浮液或切片的材料中，发现柠檬 酸、琥珀酸、延胡索酸及乙酸等化合物在各不同组织中的氧化速率 均最快。 ●向肌肉悬浮液中加入草酰乙酸，能迅速生成柠檬酸,又发现柠檬酸 是草酰乙酰和一种来自丙酮酸或乙酸的化合物合成的。
(2). Albert Szent-Gyorgyi发现:
异柠檬酸
草酰琥珀酸
(oxalosuccinate)
α-酮戊二酸
3.3 异柠檬酸脱氢酶催化的生物学意义
异柠檬酸通过此酶催化的反应，使生物体解决了具有两个 碳原子的乙酰基氧化和降解的问题。该酶所催化断裂的C-C键 ，并不是柠檬酸循环第一步反应里进入循环的乙酰基 ,而是连接该 乙酰基的两个碳原子间的共价键。这共价键不能通过一般任何一种 断裂方式打开。在二碳分子中也不能发生述的β-裂解。相反，乙酰 基一旦与草酰乙酸缩合，就形成对β-裂解敏感的产物。
2) 类似物抑制及其应用：
（1）丙酮酰-CoA是乙酰-CoA的类似物,可能代替乙酰-CoA与柠檬酸合酶结 合。 （2） 由氟乙酸形成的氟乙酰-CoA可被柠檬酸合酶催化与草酰乙酸缩合生成 氟柠檬酸，氟柠檬酸结合到顺-乌头酸酶的活性部位上，抑制 柠檬酸循环向 下进行。 ● 氟乙酸和氟乙酰-CoA可做杀虫剂或灭鼠药，各种有毒植物的叶子大部 分含有氟乙酸，可作为天然杀虫剂。
3.4 异柠檬酸脱氢酶
(1). 高等动植物及大多数微生物中异柠檬酸脱氢酶有两类：一类
以NAD+为辅酶，存在于线粒体中，一类以NAPD+为辅酶， 存在于线粒体和细胞质中。
(2). 异柠檬酸脱氢酶是一个变构酶，活性受ADP变构激活(ADP能
增强酶与底物的亲和力)。该酶与异柠檬酸、Mg 2+、NAD+、 ADP的结合有相互协同作用。NADH、ATP对该酶起变构抑制 作用。 脱羧形成-酮戊二酸；二是在能量充足时，经异柠檬酸裂解 酶作用，生成琥珀酸和乙醛酸。
3
4 Si
其甲基失去一个氢离子而成负碳离 子。负碳离子由于CoA相接的硫酯的 存在,能发生烯醇化作用[3→4]。它们
之间的共振使负碳离子中间体得以
稳定。
第二步: 乙酰-CoA负碳离子向草酰乙酸的羰
草酰乙酸
基进行亲核攻击,形成柠檬酰-CoA
(仍连接在酶分子上)。
第三步: 柠檬酰-CoA水解为柠檬酸和CoA。
起电子“陷井”作用
丙酮酸-TPP加成物‧E1
较稳定的负碳离子
羟乙基-TPP-E1 (暂时稳定的共振形式)
（2). 羟乙基氧化形成乙酰基
羟乙基氧化转变为乙酰基并转移至二氢硫辛酰转乙酰基酶E2的辅 基硫辛酰胺上，这是为下一步反应作准备。丙酮酸脱氢酶组分(TPP-E1 )完成了乙酰基的转移后即恢复原状，又可接受另一丙酮酸分子。
乙酰辅酶A
丙酮酸
羟乙基-TPP
氧化型硫辛酰胺
这一步反应是使氧化型硫辛酰胺再生的反应。
2.3.1反应机制
这一步反应使氧化型硫辛酰胺再生,在此反应中，催化此反应的 酶为二氢硫辛酸脱氢酶E3（其辅基为FAD），使二氢硫辛酰胺再氧 化,从而使其完成整个反应过程，重新形成氧化型二氢硫辛酰转乙酰 基酶。
互換反应 活泼 氧化型二氢硫辛酸 脱氢酶(E3) 还原型二氢硫辛酰 转乙酰基酶(E2) 还原型二氢硫辛酸 脱氢酶 氧化型二氢硫辛酰 转乙酰基酶
氟乙酸 (fluoroacetate)
氟柠檬酸 (fluorocitrate)
丙酮酰-CoA (acetony1-CoA)
2、柠檬酸异构化成异柠檬酸
2.1 反应方wk.baidu.com式
在pH7.0，25C的平衡态时，柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：4：6, 由于异柠檬酸在下一步反应中极迅速地被氧化,从而推动此反应向异柠檬酸的方 向进行。
O2
CO2 & ATP
綫粒体:降解脂肪酸,氧化丙酮酸以提供能量
MITOCHONDRION: reduce fatty acid and oxidize Pyruvate to produce ATP.
二、由丙酮酸形成乙酰CoA
丙酮酸进入线粒体转变为乙酰CoA,这是连 接糖酵解和三羧酸循环的纽带： ● 反应不可逆，分4步进行，由丙酮酸脱氢酶复
H 2O
前-S方向 (pro-S-arm) 前-R方向 (pro-R-arm) S-柠檬酸-CoA (S-citry1-CoA) 柠檬酸 (本身为对称分子) (citrate)
CoA
1.4 柠檬酸合酶
柠檬酸合酶是柠檬酸循环的关键酶。 1）其活性受ATP、NADH、琥珀酰-CoA、脂酰-CoA等的抑制。