《细胞生物学》综合性实验项目申报表
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3、实验用品
(1)材料洋葱（或其他）
(2)器材显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计
(3)试剂
1. 0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)
0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3）50ml
0.15mol/L NaCl
双蒸馏水加至1000ml
2. PB
0.2mol/L Na2HPO4 77ml
（3）、M缓冲液轻轻洗细胞3次（3-5min/次），M缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
（4）、3%戊二醛-PBS液固定细胞5-15min（不制备永久装片，甲醇-冰醋酸混合液。固定15-25min？）。
（5）、PBS液洗涤细胞若干次（3次，3-5min/次），用滤纸吸干。
（6）、0.2%考马斯亮蓝R250染色30min，小心用水漂洗，空气干燥，封片，观察。（蒸馏水洗2次，滴加二甲苯透明？，制成水装片）
0.2mol/L NaH2PO4 23ml
3. M-缓冲液
咪唑(PH 6.7) 50mmol/L
KCl 50mmol/L
MgC12 0.5mmol/L
EGTA 1mmol/L
EDTA 0.1mmol/L
巯基乙醇1mmol/L
甘油4mmol/L
用1mol/L HCl调pH至7.2。
4. 1%的Triton X-100/M-缓冲液
二、实验原理
细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管、中间纤维。一些细胞骨架系统的装配和去装配在时间和空间上是高度有序的，在体外，它们在温度、离子、化学药物等因素的作用下，可进行装配或去装配过程。
三、实验要求
实验前，学生必须先预习细胞骨架系统的组成，骨架系统在体外的装配条件等相关知识内容，查阅关于温度、紫外线、秋水仙素对体外细胞骨架系统装配的影响等资料文献，并写出具体的实验方案
（2）、细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。
四、主要仪器、试剂
显微镜、普通冰箱、低温冰箱、紫外灯、培养箱等
五、实验方案
（一）考马斯亮蓝法显示细胞骨架
1、蛋白质的细胞化学：
（1）蛋白质是细胞中重要的结构和功能成分，某些染料能与蛋白质的氨基酸残基结合，产生颜色反应，借以对蛋白质进行显示。这种对蛋白质直接染色的细胞化学方法并不多，特异性也不强。
（2）目前，应用最广泛的方法是利用免疫标记技术对蛋白质进行特异性显示，通过荧光标记细胞骨架成分的单克隆抗体对细胞骨架蛋白进行显示。
取大小为0. 5cm×0. 5cm的洋葱鳞茎表皮8张,其中2张浸入0. 1mol/L的CaCl2溶液中处理1h ,两张处理2h ,两张处理4h ,另外两张不做处理,设为对照。
5. 0.2%考马斯亮蓝R250染液
甲醇46.5ml
冰醋酸7ml
蒸馏水46.5ml
6. 3%戊二醛- PB溶液（PH7.3）
4、实验方法和步骤：
（1）、洋葱表皮细胞取材后，用PBS液轻轻漂洗。（3次，3min/次）
（2）、用1%TritonX-100/M缓冲液处理15min（30min），室温或者37℃均可。
（2）、实验操作中，Triton的抽提是最关键的步骤，应注意抽提适度,建议应控制在30min左右。
（二）不同处理条件对植物细胞骨架的影响
每小组4人，自选温度、紫外线、秋水仙素等处理当中的某一因素，观察这个因素对洋Hale Waihona Puke Baidu细胞骨架系统的影响。设计这个因素的三个或三个以上梯度，对洋葱细胞处理相同的时间后，观察洋葱细胞骨架系统的状态，并拍摄出显微镜观察的结果。
2、细胞中的细胞骨架成分：
（1）、细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构。其概念具有狭义和广义之分：狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同包括微丝、微管和中间纤维；广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。
文献中参考方案：
1洋葱细胞骨架制备的关键条件优化
取洋葱内表皮8张，大小约0.5cm×0.5cm，放到培养皿中，然后用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡8min，加入1%Triton X- 100分别处理洋葱内表皮10min、15min、25min和45min以优化最佳观察条件。
2各种处理
2.1温度处理方法
撕取洋葱鳞茎上的鳞叶,置于4个培养皿中,分别在- 18℃冰箱、4℃冰箱、50℃培养箱和20℃(对照)中处理1h。
2.2紫外线照射方法
撕取洋葱鳞茎上的鳞叶,置于2个培养皿中,分别在紫外灯下照射0min (对照组)和60min。
2.3Ca2+处理方法
取大小为0.5cm×0.5cm的洋葱鳞茎表皮8张，分别取2张浸入0.05mol/L、0.10mol/L和0.15mol/L的CaCl2溶液中处理2h，另外两张不做处理，设为对照。
综合性、设计性实验项目指导书
《细胞生物学》
实验项目：不同处理条件对植物细胞骨架的影响
龙岩学院学院（系）
年 月 日
实验学时：6学时
实验类型：（综合、设计）设计
每组人数：4人／组
适用专业：
一、实验目的
通过本实验的学习，使学生了解在体外，温度、紫外线、化学性药物等对细胞骨架系统装配的影响，训练学生如何设计实验步骤来验证书本的知识点，使知识点掌握得更牢固，从而培养学生动手操作能力，独立思考问题，并通过查阅资料解决问题的能力，为今后遗传学的学习、毕业论文的完成等奠定基础。
（7）、用普通光学显微镜观察，可见到深蓝色的纤维束，粗细不等，基本上平行排布，张力纤维是一种动态结构，在充分贴壁铺展的细胞中纤维挺直、丰富，形态比较典型，当将贴壁培养的细胞从基质表面除下时，细胞变圆，张力纤维随之消失。
取洋葱内皮1cm左右
置于含PBS液的载玻片上
湿润后，吸去PBS
加2滴1%Triton X-100/M-缓冲液，15-30min
吸去缓冲液，M缓冲液轻轻洗细胞3次，加3%戊二醛-PB溶液，固定25min？
加PBS洗2次，共3min
加0.2%考马斯亮蓝R250染色30min
用PBS洗2次，共2min，吸干
镜检并绘图
图4-4细胞骨架标本制作过程
5、实验操作注意事项：
（1）、每一次加液或染色后，应用PBS洗2次，并用滤纸吸干。PBS冲洗应适度，否则洋葱表皮细胞吸收大量水分易使液泡过分涨大，影响实验结果的观察。
(1)材料洋葱（或其他）
(2)器材显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计
(3)试剂
1. 0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)
0.2mol/L Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3）50ml
0.15mol/L NaCl
双蒸馏水加至1000ml
2. PB
0.2mol/L Na2HPO4 77ml
（3）、M缓冲液轻轻洗细胞3次（3-5min/次），M缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
（4）、3%戊二醛-PBS液固定细胞5-15min（不制备永久装片，甲醇-冰醋酸混合液。固定15-25min？）。
（5）、PBS液洗涤细胞若干次（3次，3-5min/次），用滤纸吸干。
（6）、0.2%考马斯亮蓝R250染色30min，小心用水漂洗，空气干燥，封片，观察。（蒸馏水洗2次，滴加二甲苯透明？，制成水装片）
0.2mol/L NaH2PO4 23ml
3. M-缓冲液
咪唑(PH 6.7) 50mmol/L
KCl 50mmol/L
MgC12 0.5mmol/L
EGTA 1mmol/L
EDTA 0.1mmol/L
巯基乙醇1mmol/L
甘油4mmol/L
用1mol/L HCl调pH至7.2。
4. 1%的Triton X-100/M-缓冲液
二、实验原理
细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管、中间纤维。一些细胞骨架系统的装配和去装配在时间和空间上是高度有序的，在体外，它们在温度、离子、化学药物等因素的作用下，可进行装配或去装配过程。
三、实验要求
实验前，学生必须先预习细胞骨架系统的组成，骨架系统在体外的装配条件等相关知识内容，查阅关于温度、紫外线、秋水仙素对体外细胞骨架系统装配的影响等资料文献，并写出具体的实验方案
（2）、细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。
四、主要仪器、试剂
显微镜、普通冰箱、低温冰箱、紫外灯、培养箱等
五、实验方案
（一）考马斯亮蓝法显示细胞骨架
1、蛋白质的细胞化学：
（1）蛋白质是细胞中重要的结构和功能成分，某些染料能与蛋白质的氨基酸残基结合，产生颜色反应，借以对蛋白质进行显示。这种对蛋白质直接染色的细胞化学方法并不多，特异性也不强。
（2）目前，应用最广泛的方法是利用免疫标记技术对蛋白质进行特异性显示，通过荧光标记细胞骨架成分的单克隆抗体对细胞骨架蛋白进行显示。
取大小为0. 5cm×0. 5cm的洋葱鳞茎表皮8张,其中2张浸入0. 1mol/L的CaCl2溶液中处理1h ,两张处理2h ,两张处理4h ,另外两张不做处理,设为对照。
5. 0.2%考马斯亮蓝R250染液
甲醇46.5ml
冰醋酸7ml
蒸馏水46.5ml
6. 3%戊二醛- PB溶液（PH7.3）
4、实验方法和步骤：
（1）、洋葱表皮细胞取材后，用PBS液轻轻漂洗。（3次，3min/次）
（2）、用1%TritonX-100/M缓冲液处理15min（30min），室温或者37℃均可。
（2）、实验操作中，Triton的抽提是最关键的步骤，应注意抽提适度,建议应控制在30min左右。
（二）不同处理条件对植物细胞骨架的影响
每小组4人，自选温度、紫外线、秋水仙素等处理当中的某一因素，观察这个因素对洋Hale Waihona Puke Baidu细胞骨架系统的影响。设计这个因素的三个或三个以上梯度，对洋葱细胞处理相同的时间后，观察洋葱细胞骨架系统的状态，并拍摄出显微镜观察的结果。
2、细胞中的细胞骨架成分：
（1）、细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构。其概念具有狭义和广义之分：狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同包括微丝、微管和中间纤维；广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。
文献中参考方案：
1洋葱细胞骨架制备的关键条件优化
取洋葱内表皮8张，大小约0.5cm×0.5cm，放到培养皿中，然后用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡8min，加入1%Triton X- 100分别处理洋葱内表皮10min、15min、25min和45min以优化最佳观察条件。
2各种处理
2.1温度处理方法
撕取洋葱鳞茎上的鳞叶,置于4个培养皿中,分别在- 18℃冰箱、4℃冰箱、50℃培养箱和20℃(对照)中处理1h。
2.2紫外线照射方法
撕取洋葱鳞茎上的鳞叶,置于2个培养皿中,分别在紫外灯下照射0min (对照组)和60min。
2.3Ca2+处理方法
取大小为0.5cm×0.5cm的洋葱鳞茎表皮8张，分别取2张浸入0.05mol/L、0.10mol/L和0.15mol/L的CaCl2溶液中处理2h，另外两张不做处理，设为对照。
综合性、设计性实验项目指导书
《细胞生物学》
实验项目：不同处理条件对植物细胞骨架的影响
龙岩学院学院（系）
年 月 日
实验学时：6学时
实验类型：（综合、设计）设计
每组人数：4人／组
适用专业：
一、实验目的
通过本实验的学习，使学生了解在体外，温度、紫外线、化学性药物等对细胞骨架系统装配的影响，训练学生如何设计实验步骤来验证书本的知识点，使知识点掌握得更牢固，从而培养学生动手操作能力，独立思考问题，并通过查阅资料解决问题的能力，为今后遗传学的学习、毕业论文的完成等奠定基础。
（7）、用普通光学显微镜观察，可见到深蓝色的纤维束，粗细不等，基本上平行排布，张力纤维是一种动态结构，在充分贴壁铺展的细胞中纤维挺直、丰富，形态比较典型，当将贴壁培养的细胞从基质表面除下时，细胞变圆，张力纤维随之消失。
取洋葱内皮1cm左右
置于含PBS液的载玻片上
湿润后，吸去PBS
加2滴1%Triton X-100/M-缓冲液，15-30min
吸去缓冲液，M缓冲液轻轻洗细胞3次，加3%戊二醛-PB溶液，固定25min？
加PBS洗2次，共3min
加0.2%考马斯亮蓝R250染色30min
用PBS洗2次，共2min，吸干
镜检并绘图
图4-4细胞骨架标本制作过程
5、实验操作注意事项：
（1）、每一次加液或染色后，应用PBS洗2次，并用滤纸吸干。PBS冲洗应适度，否则洋葱表皮细胞吸收大量水分易使液泡过分涨大，影响实验结果的观察。