肿瘤细胞培养

类固醇细胞瘤
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一、肿瘤细胞培养技术
2、分离
培养液中1mm3的组织块，仅有少量处于周围的细胞可能生存和生长。若要获 得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。目前分散组织的 方法有机械和化学两种，要根据组织种类所需和培养要求，采用适宜的手段。 机械法：机械分散发、剪切分离法 消化分离法：胰蛋白酶消化法、胶原酶法
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三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测
1、目的
一旦培养的肿瘤细胞生长成为形态单一的细胞群体后，不论是用于短期实验 研究，还是用于建立细胞系，都需要进行一系列的细胞生物学鉴定。 其目的在于： 1、 证明培养细胞是否来自原来的肿瘤细胞： 2、说明肿瘤组织类型； 3、描述肿瘤细胞的生物学特性。
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一、肿瘤细胞培养技术
2、分离
剪切分离法:在进行组织块移植培养时，可以采用剪切发，即将组织剪或 切成小块然后分离培养。
步骤：1、首先将经修整和冲洗过的组织块放入小烧杯中，用剪刀反复剪 切组织至似糊状。 2、用吸管吸取缓冲液或无血清培养液加入烧杯中，反复轻轻吹打， 低速离心去上清剩下的组织小块即可用于培养。
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细胞生长曲线
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三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测
2、检查项目
软琼脂培养：软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些恶性肿瘤 细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软 琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分 化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。 步骤：1、制备1.2%和0.7%浓度的琼脂糖溶液，灭菌备用。 2、制备20%FBS+2x1640+2xPS营养液。 3、铺下胶：1:1混合1.2%与营养液，混匀，凝固，备用。 4、铺上胶：1:1混合0.7%与营养液，加入细胞悬液， 混匀铺到下胶上，凝固后培养箱培养，10-14d。
冷 消 化
共 同 步 骤
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二、肿瘤细胞的培养
1、原代培养
我们为何要进行原代培养？ 1、建立各种细胞系的第一步 2、是获取细胞的主要手段 3、组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生大变化 4、最接近和反映体内生长特性，适合做药物测试、细胞分化等试验 原代培养方法有组织块法、消化培养法、器官培养法等。最基本和最常用 的是组织块法和消化培养法。
人成骨肉瘤细胞
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人白血病细胞
三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测
2、检查项目
细胞生长特征：检测细胞生长曲线、细胞核分裂指数、倍增时间以及细胞周期 等。癌细胞失去正常的接触抑制，细胞呈多层生长，细胞倍增 时间较短，细胞生长密度增加，细胞核分裂指数较高，并具有 无限增殖能力，细胞侵袭能力较强等特性。
2、检查项目
动物致瘤试验：用(1—20)x106个／mL细胞密度癌细胞悬液接种裸鼠背部 皮下，能够生长成为实体瘤，其组织学形态与原发肿瘤相似。
Balb/c裸鼠体内的干细胞致瘤实验
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四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输
1、冻存 细胞冻存是指将细胞混悬于冻存液中，以一定的冷冻速度将细胞悬液降 至-70℃以下，常于-196℃的液氮罐中长期保存。细胞冻存可保持传代细 胞某些性质的相对稳定，同时也减少了长期传代中支原体等微生物污染的 机会。 原理： 向将要冻存的细胞中加入陈存液，内含10％甘油或二甲亚矾，可 降低冰点，减少细胞内外冰晶的形成，从而降低了细胞在冻存过 程中的损伤程度。细胞可在-70℃以下冰箱或液氮罐中长期保存。
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二、肿瘤细胞的培养
1、原代培养
器官培养是指从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离，保持其 原有器官的结构和连接，直接将器官或器官的一部分在体外培养，在培养 过程中保持器官或其一部分组织的结构和功能。器官培养主要强调器官组 织的相对完整性，重点观察细胞正常联系和排列情况下，它们之间的相互 影响，和局部环境的失物调节作用等。
四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输
3、运输 在购买和交换培养细胞时，需根据保存方式和运输时间，采用适当的运输方法。 1、充液法运输：选生长良好的细胞，待接近或刚刚连接成片后，去掉培养 液，加入新鲜培养液至培养瓶颈部(保留少量空气)，拧紧 瓶盖，然后用封口膜将瓶口密封。到达目的地后，弃去多 余培养液，臵37℃培养，次日传代。 2、冰瓶运输：在较短时间内运输细胞，可将未冷冻的细胞悬液放入装有碎 冰的冰瓶内，以保持细胞活力。 3、液氮罐运输：细胞冻存后，将有细胞的冻存管放人液氮罐内进行运输。 在液氮罐搬运过程中，要防止液氮外漏。
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一、肿瘤细胞培养技术
2、分离
胰蛋白酶消化法：适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝等 组织。对传代细胞效果也很好，胰蛋白酶消化效果主要与 PH值、温度、浓度、组织块大小和硬度有关。
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一、肿瘤细胞培养技术
2、分离
热 消 化
1、将组织块剪切成1~2mm3 2、加入胰蛋白酶37℃热消化 3、过筛200目 4、必要时重复 5、加入胰蛋白酶冷消化6-24h 6、沉淀去上清 7、加新的胰蛋白酶37℃消化30min 8、过筛 9、离心去上清 10、加入血清培养基吹打 11、计数 12、接种瓶培养
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二、肿瘤细胞的培养
2、传代培养
肿瘤细胞的传代是人们利用培养肿瘤细胞作为进一步研究的靶材料。细胞 性状的好坏直接影响研究的结果。常见肿瘤细胞的传代多指细胞系的传代， 大致分为两种：一种是贴壁型细胞传代；另一种是悬浮型细胞传代。
注意事项：1、细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前（80%）， 不要急于传代。 2、不同的细胞有不同的消化时间 ，因而要根据需要注意观察 及时处理。 3、吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。 4、首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞尽可能适应新环 境利于细胞生存和增殖。
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二、肿瘤细胞的培养
2、传代培养
CHO贴壁细胞
开始培养
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48h形成致密单层
二、肿瘤细胞的培养
2、传代培养
加入0.25%胰酶
皱缩边缘、间隙增大、不再致密
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二、肿瘤细胞的培养
2、传代培养
基本皱缩变圆
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四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输
1、冻存 方法 1、选用指数生长期的细胞，在冻存细胞前1d换液1次。 2、贴壁细胞需用常规方法将细胞消化下来，制备成单细胞悬液。收集单 细胞悬液，然后离心(1000r/min，离心5min)。 3、弃上清，用冻存液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度至(1—10)x106/ml。 4、将细胞悬液按冻存管大小分装(0.5-1.5ml/管)，扭紧管盟，注明细胞 名称和冻存日期。 5、将上述冻存管在4℃下放臵30 min，然后将冻存管移人-80℃超低温 冰箱或液氮中保存。 6、为保持细胞最大存活率，—般采用逐渐降温的方法，标准冷冻速为 -2~-1℃/min，当温度达到-25℃时下降速率可加速至-10~-5℃/min， 到-100℃可迅速放入液氮罐中。
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二、肿瘤细胞的培养
2、传代培养
1、贴壁型细胞的传代 步骤：1、选取生长良好的细胞一瓶，轻轻摇晃培养瓶，倒掉培养液， 缓冲液洗一遍。 2、从无细胞侧加入0.25%的胰蛋白酶，翻转培养瓶，使消化液 浸没细胞1min左右。 3、翻转培养瓶，放臵5-10min，观察细胞出现布纹孔状为止。 4、倒掉消化液。 5、沿细胞面加入适量生长液,洗下细胞，吹散，按1:2或1:3传 代培养。 6、37℃培养，接种后30min可贴壁。48h换液一次，3-4d形 成单层细胞。
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四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输
2、复苏 注意事项： 1、应在1min内使冻存细胞完全融化，复温速度太慢会造成细胞损伤。 2、复苏过程中应戴手套和护目镜。冻存管可能涌入液氮，解冻时冻存管 内的气温急剧上升，可导致爆炸，应予以注意。
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细胞冻存、复苏步骤
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三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测
2、检查项目
1、组织起源：对培养材料应说明起源于哪个胚层，什么器官的何种组织； 来 源于什么样的供体，患有何种疾病，辅助鉴别细胞的来源。 2、形态学观察：细胞一般形态，如细胞形状、核浆比例、染色质 和 核仁大 小及多少，以及细胞骨架的排列等。培养底细胞多呈多角 形．大小异型性明显，核浆比例倒臵．有丰富的三极或多 极有丝分裂，核仁清晰、多个，微丝、微管排列紊乱等。
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二、肿瘤细胞的培养
1、原代培养
组织块培养法是一种简便易行且成功率较高的常用原代培养方法。即将 组织剪切成小块后，接种于培养瓶。培养瓶可根据不同细胞生长的需要 作适当处理。例如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长，涂 以多聚赖氨酸培养需旺细胞等，适用于组织量少的原代培养。
完全皱缩变圆，弃去胰酶，将细胞洗下
二、肿瘤细胞的培养
2、传代培养
2、悬浮型细胞传代 步骤：1、选取生长良好的细胞一瓶，轻轻加入适量生长液。 2、用无菌吸管轻轻吹打，使细胞悬浮，吸出一半的细胞悬液， 加入到新的培养瓶中。 3、37℃，5%CO2 培养箱中培养24-48h。 4、如细胞浓度较高，可按1:3进行传代。
肿瘤细胞的培养
一、肿瘤细胞培养技术 二、肿瘤细胞的培养 三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测 四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输 五、总结
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一、肿瘤细胞培养技术
1、取材
肿瘤细胞培养材料主要来源于外科手术或活检的瘤组织。取材部位非常重要 体积较大的肿瘤组织中央常有退变或坏死区，取材时应去掉坏死组织，故应 去瘤体的周围瘤组织做培养，癌性转移的淋巴结或癌性胸腹水是较好的培养 材料。取材后应尽快进行培养，如因故不能立即培养，可按正常组织储存方 法保存，将组织剪成1mm3左右的小块，放入培养液中，臵4℃保存，但存放 时间不宜超过24h。取材时应注意无菌操作。
1、取材修剪冲洗 2、剪成1mm3小块 3、移入培养瓶 4、分布组织小块间距5cm 5、翻转培养瓶并加入适量培养液， 37℃静臵2-4h 6、翻正培养瓶进行培养 7、原代细胞生长
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二、肿瘤细胞的培养
1、原代培养
这种方法采用前述的组织消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质包括基 质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸收养分和排出代 谢产物，可以很快得到大量活细胞，细胞也可能在短时间内生长成片。适 用于培养大量组织，原代细胞产量高；但步骤繁琐、易污染，一些消化酶 价格昂贵，实验成本高。 步骤：1、按消化分离法收获细胞。 2、待组织已分散成细胞团或单个细胞，则终止消化，过筛200目 过掉组织块，大块组织继续消化。 3、收集过滤消化液离心1000rpm/min，5min，去上清加含血清 培养液，轻轻吹打形成细胞悬液，计数后接种到培养瓶，臵 CO2培养箱培养。
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三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测
2、检查项目
细胞核型分析：检测核型特点、染色体数量、有无标记染色体、染色体带型等。 癌细胞染色体数日和结构异常，大多为异倍体，并可出现异常 的标记染色体。
一个癌细胞的染色体共104条，包括许多异常的染色体
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三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测
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四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输
1、冻存
细胞冻存步骤
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四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输
2、复苏 细胞复苏指按一定的复温速度将冻存的细胞恢复到常温。当恢复到常温状态 时，冻存细胞的形态结构保持正常，代谢反应即可恢复。 方法： 1、 取出冻存管，立即放入37-40℃水浴锅中，快速摇晃直至完全融化 (应在1min内完成)。 2、 离心细胞(1000r/min，5min)后，弃上清。用少量生长液悬浮细 胞，转入培养瓶中配成所需要的细胞浓度，培养箱培养。 3、 无菌操作打开冻存管，将细胞悬液吸到培养瓶中，补足生长液后， 臵5％CO2 37℃)培养箱中培养。4—6h后，待细胞贴壁，轻轻倒 掉含冻存液的生长液，换生长液后继续培养。