葡萄糖氧化酶-生物化学与分子生物学

实验一 血清葡萄糖测定
一、实验目的 1. 掌握血糖的基本知识及空腹血糖、餐后血 糖检测在糖尿病诊疗中的应用。
2. 掌握葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖浓度 的原理与操作过程。
二、背景与原理
（一）背景
应用酶学方法测定血液葡萄糖是临床化学中的主流方法。最常用的 酶学方法有葡萄糖氧化酶法和己糖激酶法。其特点是具有较高的灵敏度、 准确度和精密度，使用温和的反应条件，操作简单方便，适用于自动分 析仪。
己糖激酶法：第一步是在己糖激酶催化下，葡萄糖和ATP发生磷酸化反应， 生成葡萄糖-6-磷酸；第二步是在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下，葡萄糖-6磷酸和NAD或NADP发生氧化还原反应，生成6-磷酸葡萄糖酸和NADH或 NADPH。在波长340nm处，监测吸光度的增高。吸光度的净增高值与葡 萄糖浓度成正比。己糖激酶方法和葡萄糖氧化酶方法相比对葡萄糖的特 异性更高，不受尿酸和抗坏血酸的干扰，特别适用于急诊检验使用。
实验专题模块一 血糖和血糖的 调节
血清葡萄糖测定 糖化血清蛋白（果糖胺）测定
生化实验室守则
请同学们仔细阅读《生化实验室守 则》，并注意遵守。
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微量移液器的使用
1. 2. 3. 4. 5. 选择合适的移液器。 吸头安装。 容量设定。 预洗吸头：在我们安装了新的吸头或增大了容量值以后，应该把需 要转移的液体吸取、排放两到三次。 吸液：先将移液器排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直进入液面， 浸入的深度为：P2、P10小于或等于1毫米，P20、P100、P200小于 或等于2毫米，P1000小于或等于3毫米，P5ml、P10ml小于或等于4 毫米，平稳松开按钮，切记不能过快。 放液：放液时，吸头紧贴容器壁，先将移液器排放按钮按至第一停 点，略做停顿后，再按至第二停点。 卸去吸头：用过的吸头如果不用了，可以用拇指按住移液器顶端的 另一个按钮，把枪头打掉。 移液器容量复原：使用完毕，把枪调到最大量程，这样有利于枪的 保养。
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糖尿病
糖尿病是由于胰岛素分泌不足或/和胰岛素作用低下而引起的代谢 紊乱综合征，高血糖是其最主要特征。根据病因，糖尿病可分为不同 类型，主要包括1型、2型、其他特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病等。 最近30年我国糖尿病患病率急速增长，约增长了15倍, 成为世界第 一糖尿病大国。中国最新流行病学调查显示，2型糖尿病在成年人高 度流行，年龄标化的总糖尿病患病率为9.7%。 正常血糖是空腹静脉血浆葡萄糖<3.89～6.11mmol /L。若空腹血糖 >7.00mmol/L和餐后2小时血糖>11.10mmol/L即为糖尿病。 糖化血清蛋白（果糖胺）测定可反映糖尿病患者抽血前2-3周内血糖 总的水平，亦为糖尿病病人近期监测指标，正常值为1.7～2.8mmol/L。 HbA1c测定可反映糖尿病患者抽血前8～12周的血糖控制情况，病情 控制不良的糖尿病病人其HbA1c较正常人高，且与病情控制不良程度 相关，正常值为<6.5%。 血浆胰岛素和C肽测定有助于了解胰岛B细胞功能和指导治疗，空腹 血浆胰岛素正常值为5～15mU/L，正常人血浆基础C肽水平300～ 600pmol/L。
6. 氧化酶法测定血糖：取试管，做好标注后，按下表进行操 作：
加入物 (ml) 血清（以上各 实验组获得） 葡萄糖标准应 用液 蒸馏水 酶酚混合试剂 测定管 0.02 0 0 2.0 标准管 0 0.02 0 2.0 空白管 0 0 0.02 2.0
混匀后，置于37℃水浴箱中，恒温水浴15分钟。然 后用722型分光光度计，波长505nm，以空白管调零， 分别读取标准管和测定管吸光度，并按以下公式计 算结果： 血清葡萄糖（mmol/L）=（测定管吸光度/标准管吸 光度）× 标准液浓度
5. 第三只兔子的处理：先按2U/kg体重给兔子注射胰岛素， 45分钟后割破家兔耳朵血管，留取血液1-2ml；马上按 0.4ml/kg体重给予注射0.1%的肾上腺素，30分钟后留取血液12ml。以上血液均分离出血清备用。（以下实验中，整个实验
班以6人/组分组，在各个组中，每两个人负责一只兔子的样品检 测）。
葡萄糖氧化酶：本法分极谱分析法和比色法两类。但二者的初 反应都是在葡萄糖氧化酶的催化下，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸， 同时消耗溶液中的氧，产生过氧化氢。极谱分析法是用氧电极 监测溶液中氧的消耗量，氧的消耗量与葡萄糖浓度成正比。比 色分析法是用葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的偶联反应系统。 初始反应中过氧化氢的生成量与葡萄糖浓度成正比。在辣根过 氧化物酶进行比色测定。该法的缺点是易受还原性物质如胆红 素、抗坏血酸和尿素等干扰，但准确度与精密度都能达到临床 要求，操作简便，是目前临床推荐常规检验的方法。
（二）原理
1. 葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸（D-葡 萄糖酸-δ-内酯），并产生一分子过氧化氢。 2. 在色原性受体（4-氨基安替比林偶氮酚）的存在下，过氧 化物酶（POD）可将过氧化氢分解为水和氧，并使4-氨基 安替比林和酚去氢缩合成红色醌亚胺，即Trinder反应。红 色的醌类化合物生成量与葡萄糖含量成正比。 其反应如下：
2葡萄糖 + 2H2O+O2 2葡萄糖酸+ 2H2O2 2H2O2 + 4-氨基安替比林+酚 醌亚胺+ 4H2O
醌亚胺在480～550nm波长有最大吸收，与同样处理的标准液 比较，经计算可求出血浆葡萄糖含量。
POD
GOD
四、 实验操作
1. 准备健康成年家兔三只（每个实验班），常规饲养。
2. 将三只家兔固定在兔盒上，割破耳沿静脉并留取对 照血液1-2ml，凝固后分离出血清备用【血清分离： 待凝固后（约20-30分钟），3000～5000rpm，离心 5～10分钟，将上清转移至另一离心管中】。 3.按2U/kg体重给第一只兔子注射胰岛素，然后用采血 管分别在注射后45分钟和90分钟等时间点，割破家兔 耳朵血管，留取家兔血液各1-2ml，分离出血清后备 用。 4.按0.4ml/kg体重给第二只兔子注射0.1%的肾上腺素， 然后用采血管分别在注射后30分钟和60分钟等时间点， 割破家兔耳朵血管，留取家兔血液各1-2ml，分离出 血清后备用。