三代PCR技术原理及优劣

北京新羿生物
Hale Waihona Puke 然后直接计数样本中突变型和野生型等位子的数量。 主要应用于突变分析、等位基因缺失、混杂DNA的癌症检测等等。
技术优点 1.灵敏度更高 数字PCR将传统的PCR反应分割成了数万个体系，这些体系独立扩增，独立检测，保证了个位数的模板数量都可以被检测到 2.定量更准确 数字PCR通过微体系的荧光计数，直接将反应初始模板数量统计出来，即使某些微滴中的模板数量不止一个，也可以通过泊松分布进行计算。 3.抗干扰能力更强 数字PCR第一步反应体系的分配过程中，会将模板和抑制物分配到不同的体系，降低抑制物的干扰。并且，与qPCR不同的是，dPCR检测的是终点荧光，即 使微体系稍微受到了影响，也不会影响最终结果的判读。 技术缺点 1.模板质量要求较高 由于数字PCR将反应拆分成了数万个独立体系，因此其对模板量有比较高的要求，模板量超过微体系量会导致无法定量，过少会导致信号过低，降低定量 准确度。 2.非特异性产物的判断 数字PCR观测的是每个体系中的终点荧光，无论PCR产物是否是特异性产物，只要荧光信号足够强，也是会判读为阳性结果。因此dPCR的引物特异性要求 极高。
第二代PCR技术——实时荧光定量PCR
技术原理图解
第二代PCR就是实时荧光定量PCR技术（Real-Time PCR），也叫做qPCR, 荧光定量PCR通过在反应体系 中加入能够指示反映进程的荧光探针，通过荧光信号 的积累来监测扩增产物的积累。通过荧光曲线来判断 结果，并可以借助Cq值和标准曲线来实现相对定量。
原理与伯乐微液滴数字PCR相同，液滴形成能力强， 理论上可以产生1000万个小液滴
国内数字PCR厂商
重庆泛生子生物科技有限公司 广东顺德永诺生物科技有限公司
南京科维思生物科技有限公司
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杭州领航基因
第三代PCR技术——数字PCR
第三代PCR技术叫做数字PCR（Digital PCR, dPCR, Dig-PCR）,这是目前
全新的一种PCR检测方式，能对核酸进行检测和定量，采用直接计数目
标分子而不依赖任何校准物或者外表，即可确定低至单拷贝的待检靶分
子的绝对数目。
技术应用 用于大量正常细胞群中检测少数含突变的细胞。通过稀释样品DNA到对应的检测孔中，经过PCR扩增之后，向每个孔里加入特异性荧光探针与产物杂交，
目前为止，诞生于生物领域的两大技术： 1. PCR—核酸扩增技术 2. CRISPR-cas—基因编辑技术
第一代PCR技术——普通PCR
技术原理图解
第一代PCR技术就是最初的PCR，采用普通PCR扩增仪来 对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行 分析，只能做定性或半定量分析。
技术应用 能将微量的 DNA 大幅增加。因此对化石中的古生物残骸，犯 罪现场的毛发、皮肤碎屑或血液，只要能分离出一丁点的 DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。 技术优势 PCR 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术， 它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制。 技术缺点 1. 最初的PCR技术所采用的核酸染料，会对实验人员和环境 造成伤害 2. PCR完成之后需要开盖检测，容易发生污染造成假阳性结 果 3. 检测耗时长，操作麻烦，容易出错 4. 只能做定性检测
技术应用 用于传染性疾病病原体检测，疾病耐药基因研究，药 物疗效考核，遗传疾病诊断 技术优点 1. 污染风险低 2. 操作流程更简单、经济高效 3. 需要的DNA和RNA加样量少 技术缺点 1. 不同厂家生产的试剂和设备所产生的Cq值之间存在 一定的差异，并不具备可比性 2. 存在背景值的影响，结果易产生偏差 3. 对于低拷贝的DNA往往难以检测 4. 当反应体系中有PCR抑制物存在时，常规的PCR体系 经常会受到影响。
PCR技术
20200221
提纲
• PCR之父介绍 • 第一代PCR仪 • 第二代PCR仪 • 第三代PCR仪及部分国产仪器
前言
有人说：
生物学可以被划为两个时代：一个没有PCR，一个有PCR
• 凯利·穆利斯（Kary Mullis） • 1944.12.28—2019.08.07 • 大学：化学专业 • 博士：生物化学 • 选修天体物理，发表《Nature》 • PCR技术诞生：1984年 • 1993年诺贝尔化学奖
数字PCR—“微孔板”式数字PCR
使用集成微流控芯片，芯片借助微流控阀门 将注入的PCR混合液随机分散到反应室，小 室之间通过“微流体阀”分隔
20微升反应体系分散到20000个微孔中进行PCR反 应，PCR反应结束后，采用CCD拍照统计阳性反应 孔
数字PCR——微液滴数字PCR（ddPCR）
油包水反应体系，将20微升反应体系采用液滴 反应器形成20000个液滴，利用流式细胞技术 检测每一个液滴，统计阳性反应液滴数量