肿瘤细胞侵袭实验具体步骤及详细说明

肿瘤细胞侵袭实验具体步骤及详细说明
Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。

铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。

细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。

穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。

另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。

值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。

肿瘤细胞穿过重建基质膜的
能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。

在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。

另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。

一、准备
1. 溶胶，4℃过夜。

2. 室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤2和3种使用试管和枪头要在试验前-20C预冷。

二、包被基底膜（冰上操作）
1. 用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Matrigel胶。

2. 取100 ul稀释胶加到24-well transwell上室中。

3. 37℃孵育transwell至少4-5 h 。

三、水化基底膜
1. 用无血清培养基轻洗凝胶。

四、准备细胞悬液和小室
1. 消化法从细胞培养瓶中获取细胞。

2. 用培养基洗3遍。

3. 重悬细胞，5×105cells/ml，1% FBS 。

4. 上室加200 ul细胞悬液。

5. 下室中加入600 ul细胞培养基，含有5 ug/ml fibronectin作为黏连亚族。

五、孵育
37℃，20 - 24 h 。

六、染色和计数
1. 棉签擦去上室上面的非侵袭细胞。

2. 移去transwells，倒置，风干。

3. 24孔板中加入500 μl含0.1%结晶紫，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃30min后取出，PBS清洗。

4. 直径上取4个视野，照相，计数。

5. 24孔板中加入500 μl 33%醋酸，将小室置于其中，浸膜，振荡10 min，充分溶解。

取出小室，24孔板于酶标仪上570nm测OD值，间接反应细胞数。

注意事项
1. 照相前一定要晾干，照相时将小室正置于载玻片上，在倒置显微镜下观察、照相。

2. 使用 Matrivgel前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化（如过夜放置），避免反复冻融。

3. 使用时需接触Matrivgel的试管、移液吸头等均应预冷于4℃。

4. 使用 Matrivgel时注意无菌操作。