荧光定量PCR中探针法与染料法的区别
荧光定量 PCR 方法：探针法 VS 染料法？
荧光定量PCR方法：探针法VS染料法？
荧光定量PCR又称qPCR，是一项非常常见的分子生物学实验技术。
荧光定量PCR荧光为基础对核酸进行定量分析，其应用非常广泛，可以用于检测基因的表达量（RNA的丰度），验证表达谱芯片或转录组测序的数据，确定病原体的载量，对片段的拷贝数（CNV）进行分析，对基因进行分型等等。
对
?
在国内，染料法一般采用DNA染料SYBRGreenⅠ，染料法使用简单，成本也相对较低，因此会有很多国内研究者会选择使用染料法进行后续实验。
在染料法荧光定量PCR实验中，染料能够与双链结合，从而发光，而在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光。
所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。
但是染料法检测的是体系中
的所有双链DNA,因此一些非特异性扩增或者引物二聚体的出现，会极大的影响真实结果的准确性。
仅供个人学习参考
为此，一些厂商提供ROX作为内部荧光参考标准，用来校正背景，但是即便如此，染料法特异性的问题依旧无法与探针法相比。
另外染料法无法在同一个反应中检测多个目的片段，对于复杂序列，如果难以扩增的话，也会受到脱靶效应（如引物二聚体）的影响。
在这种情况下，就需要在实验前期进行熔解曲线分析，判断扩增所得产物是否只有一种。
二、TaqMan探针法
Taqman
享受
仅供个人学习参考。
实时荧光定量PCR技术
千里之行，始于足下。
Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。
染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。
荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。
目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。
二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。
2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。
3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。
4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。
三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。
荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到D NA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。
二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的T M值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量P CR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。
选择定量PC R仪的关键——由于定量PC R必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。
至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。
二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。
选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。
至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。
荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。
激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介一．实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。
但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。
因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性.如采用常规的终点检测法（利用EB 染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量),即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。
为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数-—Ct值,定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。
Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行,定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。
Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环）,“t”代表检测threshhold(阈值）,其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。
Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系(y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。
与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确,重复性也更好。
传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。
下图中是96个复孔的实时扩增曲线(完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度)，可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。
实时荧光定量PCR原理与分析方法
实时荧光定量PCR原理与分析方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种基于PCR技术的DNA定量方法，可以在实时反应过程中实时监测PCR产物的累积情况。
与传统的终点PCR相比，qPCR具有更高的灵敏度和准确性，可以定量检测非常低浓度的目标DNA。
实时荧光定量PCR的原理是利用荧光染料与PCR产物结合发出荧光信号，通过监测荧光信号的强度来测定PCR产物的数量。
qPCR有两种常用的检测方法：SYBR Green I染料法和探针法（如TaqMan探针法）。
SYBR Green I染料法是一种简单而常用的qPCR检测方法。
SYBR Green I是一种DNA结合荧光染料，在PCR反应过程中会与PCR产物的DNA结合，从而产生荧光信号。
这种方法的优点是简便、经济，但缺点是非特异性，可能产生假阳性结果。
探针法是一种更为特异和准确的定量PCR方法。
在这种方法中，需要设计一对特异性引物和一个包含荧光探针的引物。
在PCR反应过程中，引物与目标DNA特异性结合，探针结合在引物的靶区上，当PCR反应进行到延伸阶段时，Taq聚合酶会切割探针上的荧光标记，导致断裂，这样就分离出信号的发射荧光信号。
探针法具有高特异性和准确性，能够避免假阳性结果。
无论是SYBR Green I染料法还是探针法，实时荧光定量PCR的分析方法都是通过构建标准曲线并计算目标DNA的模板数量来定量分析样品中的目标物质。
首先，需要用已知浓度的目标DNA制备标准品，根据不同浓度标准品的CT值（荧光信号阈值）绘制标准曲线。
然后，将样品DNA与引物一起进行PCR扩增反应，监测荧光信号强度并记录CT值。
利用标准曲线可以计算出样品中目标物质的浓度。
荧光探针和荧光染料
荧光探针和荧光染料来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-10-18实时荧光PCR 定量包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是不利用杂交原理，而利用其他的一些理化特征指示扩增产物的增加。
前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
1．TaqMan 探针TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端， 而淬灭剂则在3’末端。
当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。
在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断， 使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。
一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。
随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。
因此Taqman 探针检测的是积累荧光。
常用的荧光基团是FAM ，TET ，VIC ，HEX 。
2．分子信标（molecular beacon）分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。
荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。
分子信标的茎环结构中，环一般为15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。
荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。
在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。
与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。
当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。
由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。
常用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。
3．SYBR Green ISYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。
荧光标记的染料法和探针法
荧光标记的染料法和探针法荧光标记的染料法和探针法，听起来是不是有点晦涩难懂？但其实说白了，这就是两种非常有趣、非常有用的实验方法，专门用来“追踪”和“观察”细胞或者分子里面的神奇世界。
要是用大家能听懂的语言解释，就是这些方法让我们能看到一些平时眼睛看不见的小东西——细胞里发生了什么，某个特定的分子在不在，甚至它们是不是还在忙着做着一些复杂的反应。
就好像你能用一个特殊的眼镜，看清楚别人眼中看不到的东西一样。
首先说到“荧光标记的染料法”，它其实就是利用一些能发光的染料来做标记，这些染料特别神奇，吸收光之后，自己会发出不同颜色的光。
你可以想象这些染料就像是一只会发光的小螃蟹，它们一碰到特定的东西，就会发出五光十色的亮光，瞬间把目标引入了你的视野。
这些染料就像是“指路明灯”，你可以用它们标记细胞的特定区域，或者是细胞里特定的分子，然后利用显微镜什么的观察到它们的样子。
比如说，我们研究一种新的药物效果，怎么知道药物是不是成功作用到细胞了？就可以把药物和一些荧光染料结合在一起，看看药物是不是在细胞里亮了起来。
这样一来，研究人员就能通过“光芒”看到药物的“到达现场”，不再是靠猜和推测了。
荧光染料法有个最大好处，那就是它能让你看得非常清楚，而且时间上也挺灵活，你可以随时观察标记的分子，看看它们是如何随着时间的推移发生变化。
你还能标记不同的东西，用不同颜色的荧光染料，看看它们是怎么“同场竞技”的。
这就像是你在看一场盛大的舞会，荧光染料们就像是舞池里的小明星，每一个都穿着不同颜色的闪亮衣服，光芒四射，想不注意都难。
不过呢，染料法虽然好，但是也有一些“小毛病”。
染料并不是永远稳定的，它们可能会因为实验条件变化，发出的光不稳定，甚至可能“耗尽电力”——就是说发光时间变短或者干脆不发光了。
那时候你可能就需要换一个新染料，或者调整实验条件，调皮的小染料可不好对付呢。
接着说说“探针法”，这个听起来是不是也有点像是间谍电影里的那种秘密武器？其实说白了，探针法就是用一些非常特殊的分子，去“探测”细胞或者分子里的某些东西。
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。
二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。
选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。
至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。
荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。
激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。
染料法和探针法荧光定量PCR(RT-qPCR)的优缺点比较
染料法和探针法荧光定量PCR（RT-qPCR）的优缺点比较一、荧光染料法(SYBR Green)其原理是：在PCR反应体系中加入过量荧光染料，DNA扩增的过程中，荧光染料特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，随着反应的进行，荧光强度逐渐增强，并且可以实时测量。
如果你要扩增你的目标样品40个循环，在最后一个循环结束时检测到的荧光会比在第10个循环测得的荧光强很多。
优点：1、成本较低，适合大规模的实验。
2、在实验设计阶段非常省时，因为它只需要合适的引物设计。
缺点：1、特异性不是很高。
染料可以插入任何双链DNA，包括引物二聚物和非特异性产物。
2、如果引物二聚体存在或者产物受到污染，得到的结果会不可靠。
3、更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。
需要更多的时间进行结果分析。
二、寡核苷酸探针(Taqman)这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短DNA分子)，探针通常在5 端和3 端都被标记。
在探针的5’端有报告基团，3’端设计淬灭基团，当报告基团接近淬灭基团时，不会检测到荧光信号。
RT-qPCR反应时，寡核苷酸两个基团分离，即可检测到荧光信号，并与PCR产物同步。
使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游互补序列的结合。
优点：1、更有可能只放大所需的产物，由于引物和探针的结合具有特异性。
2、不需要解离曲线，只有探针与正确的目的序列结合时才能检测到荧光。
3、由于具有特异性，数据更可靠。
4、数据分析时节省时间。
缺点：1、需要大规模实验时耗费成本高。
2、需要更长的时间来设计实验，因为需要好的引物和探针。
总的来说，这两种荧光检测方法都很有效，但对于你的具体实验，可以选择适合的方法。
荧光定量pcr的应用及其常用的荧光探针和荧光染料
荧光定量pcr的应用及其常用的荧光探针和荧光染料下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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染料法和探针法的原理
染料法和探针法的原理哎呀，说起染料法和探针法，这俩家伙可真是生物实验里的好帮手。
不过，别急，我可不会跟你讲那些枯燥的科学术语，咱们就像朋友一样，边喝着咖啡边聊聊。
先说说染料法吧。
这玩意儿，其实就是给细胞上色，让它们在显微镜下变得五颜六色，好让我们这些肉眼凡胎能看清楚细胞里的各种结构。
想象一下，你手里拿着一支彩笔，对着一张白纸，想画啥就画啥。
染料法也是这样，我们用不同的染料，就能标记细胞里的不同部位。
比如，我们用一种叫“苏木精”的染料，它就特别爱和细胞核里的DNA亲热，一涂上去，细胞核就变得蓝汪汪的。
这就像是你给一张白纸画了个大大的蓝色圆圈，一眼就能看出来。
然后是探针法，这个就更神奇了。
你可以把它想象成一种特殊的“钓鱼”技术。
我们用一种叫做“探针”的东西，它就像是鱼钩上的诱饵，专门吸引细胞里的特定分子。
比如说，我们想要找到细胞里的某种特定的RNA，我们就做一个和这种RNA能配对的探针。
这就像是你把一个特制的鱼饵扔进水里，只有那种特定的鱼才会上钩。
一旦探针和目标分子配对成功，我们就能通过一些化学反应让这个位置发光或者变色，这样在显微镜下就能看到那些特定的分子在哪里了。
记得有一次，我在实验室里做实验，要用染料法来观察细胞分裂。
我小心翼翼地把染料滴在载玻片上，然后盖上盖玻片。
那时候，我的心情就像是在等待一个魔术揭晓一样，既紧张又兴奋。
我把载玻片放到显微镜下，调整好焦距，哇塞，那些细胞核一个个蓝得发亮，就像是夜空中最亮的星星。
我看着它们，心里想，这些小家伙们每天都在进行着这么奇妙的变化，而我们通过染料法，就能窥探到这个秘密。
至于探针法，那次我是为了检测一种罕见的基因表达。
我制作了特制的探针，然后开始了我的“钓鱼”行动。
我把探针加到细胞样本里，然后就是等待。
你知道那种等待鱼儿上钩的感觉吗？就是那种既期待又有点焦虑的心情。
几个小时后，我再次观察样本，那些特定的基因位置真的亮了起来，就像是在跟我说：“嘿，我在这里！”那一刻，我简直比钓到大鱼还要兴奋。
定量PCR原理及PCR仪光学原理
定量PCR原理及PCR仪光学原理1.荧光染料法：在PCR反应混合液中添加荧光染料，该染料只与双链PCR产物结合并产生荧光信号，因此只有在扩增过程中产生双链PCR产物时才会有荧光发光。
PCR反应过程中，荧光信号会随着扩增产物的积累而增加。
可以通过荧光强度与PCR循环数的关系来计算出初始模板的初始数量。
2.探针法：在PCR反应中加入探针，该探针通常包含两个部分：荧光染料基团和辅助基团。
辅助基团可以竞争性结合PCR产物，从而导致荧光信号减弱或熄灭。
当PCR过程中产生PCR产物时，探针会被酶水解并释放出荧光染料基团，从而导致荧光信号增强。
通过测量荧光信号的变化，可以测量PCR 产物的数量。
PCR仪光学原理：PCR仪是用于定量PCR实验的专用仪器，它具有特殊的光学系统来测量荧光信号的强度。
PCR仪的光学原理通常基于光衰减原理。
PCR仪中使用的荧光染料或探针一般会发出荧光信号，该信号在PCR过程中会通过光学系统进行收集和测量。
PCR仪的光学系统一般包括以下几个组件：1.光源：PCR仪通常使用特定波长的光源来激发荧光信号的发生。
常见的光源有LED或氙气灯。
2.滤光片：滤光片用于选择特定波长的荧光信号传递到探测器，并阻挡其他波长。
滤光片通常由凹凸面组成，以控制特定光线的传播方向和传播方式。
3.检测器：检测器用于测量荧光信号的强度。
常见的检测器有光电二极管（photodiodes）或光电倍增管（photomultiplier tubes），它们可以将荧光信号转化为电信号。
4.放大器和转换器：放大器用于增强电信号的强度，并将其转换为数字信号。
5.软件和分析系统：PCR仪通常配备专门的软件和分析系统，用于处理和分析测量的数据。
这些软件可以计算出初始模板的初始数量，并生成相应的曲线和图表。
总结：定量PCR是一种用于测量DNA或RNA在样本中的定量浓度的技术，依赖于PCR过程中的荧光信号的监测。
荧光染料法和探针法是常用的定量PCR方法。
qpcr检测目的基因表达原理
qpcr检测目的基因表达原理qPCR检测目的基因表达原理qPCR是一种高效、快速、准确的检测方法，被广泛应用于基因表达分析、病原体检测、药物筛选等领域。
其中，基因表达分析是qPCR最常见的应用之一。
本文将介绍qPCR检测目的基因表达的原理。
qPCR是一种基于荧光信号的PCR技术，它可以定量检测PCR反应中的DNA分子量。
qPCR的原理是通过荧光染料标记的探针或SYBR Green染料来检测PCR反应中的DNA分子量。
其中，探针法是一种更为准确的方法，它可以检测到特定的DNA序列，而SYBR Green染料则可以检测到所有PCR产物。
在qPCR反应中，首先需要设计引物和探针。
引物是一对短的DNA序列，它们分别位于待检测基因的上下游，用于扩增目的基因的DNA序列。
探针是一种特殊的DNA序列，它包含一个荧光染料和一个荧光猝灭剂。
当探针与PCR产物结合时，荧光染料会被激活，发出荧光信号。
荧光猝灭剂则可以防止荧光信号的干扰。
qPCR反应分为两个阶段：扩增阶段和检测阶段。
在扩增阶段，引物和探针将PCR反应体系中的DNA序列扩增。
在检测阶段，荧光信号会随着PCR产物的增加而增加。
通过检测荧光信号的强度，可以确定PCR反应中的DNA分子量。
在qPCR反应中，需要设置一个对照组和一个实验组。
对照组是一组不含待检测基因的样本，它可以用来检测PCR反应的背景信号。
实验组是一组含有待检测基因的样本，它可以用来检测PCR反应中的目的基因表达水平。
qPCR检测目的基因表达的原理是通过比较对照组和实验组的荧光信号强度来确定目的基因的表达水平。
通常，会将实验组的荧光信号强度与对照组的荧光信号强度进行比较，得到一个相对表达量。
相对表达量越高，说明目的基因的表达水平越高。
总之，qPCR是一种高效、快速、准确的检测方法，可以用于检测目的基因的表达水平。
通过设计合适的引物和探针，以及设置对照组和实验组，可以得到准确的基因表达数据，为基因功能研究提供有力的支持。
实时荧光定量PCR技术的两种方法原理简述
实时荧光定量PCR技术的两种方法原理简述依据所使用的技术不同，实时荧光定量PCR可以分为：荧光探针和荧光染料两种方法。
现将其原理简述如下：1. TaqMan荧光探针TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3'5'外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸取；PCR扩增时，Taq酶的3'5'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分别，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成wan全同步。
而新型TaqMan—MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的shou选技术平台2. SYBR荧光染料在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的加添与PCR 产物的加添wan全同步。
SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。
SYBR荧光染料法定量PCR的基本过程是：① 开始反应，当SYBR染料与DNA双链结合时发出荧光；② DNA变性时，SYBR染料释放出来，荧光急剧削减；③ 在聚合延长过程中，引物退火并形成PCR引物；④ 聚合完成后，SYBR染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
实时荧光定量PCR技术依据化学原理可以分为探针类和非探针类。
探针类实时荧光定量 PCR 技术紧要是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的加添；非探针类实时荧光定量 PCR 技术紧要通过荧光染料来指示产物的加添。
QPCR定量简介
荧光定量PCR一、原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
优点：重复性好，特异性高，灵敏性高，可多重PCR；缺点：只适合特定目标，价格较贵，本底信号较高。
2）SYBR荧光染料：SYBR荧光染料是一种可以结合在DNA双螺旋小沟区域具有绿色激发波长的燃料。
在PCR 反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
优点：引物设计方便，价格优势；缺点：特异性差，引物要求高，灵敏度差，不能进行多重定量。
二、内标在传统定量中的意义1．几种传统定量PCR方法简介：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。
上游引物用荧光标记，下游引物不标记。
在模板扩增的同时，内标也被扩增。
在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。
在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。
荧光定量pcr检测原理
荧光定量pcr检测原理
荧光定量PCR（FQ-PCR）是一种新兴而广泛使用的PCR技术，它可以在PCR反应过程中实时监测靶分子的增殖程度。
FQ-PCR技术分为两类，一类是 SYBR Green I 技术，另一类是探针技术。
探针技术是一种比 SYBR Green I 技术更专业和更可靠的荧光定量PCR检测方法。
探针技术的原理如下：
1. 在FQ-PCR反应中，加入一个特制的探针，通常由荧光染料和两个特异性引物组成。
其中一个引物是靠近5'端，另一个引物则与荧光染料结合。
探针的3'端和5'端被两个不同的荧光染料标记（探针末端带有一个荧光基团（荧光染料））。
2. 探针在PCR反应过程中，结合到与探针引物补相对应的靶分子上。
3. 当荧光染料与靶分子结合时，荧光信号就产生了。
4.在PCR反应的进行中，FQ-PCR仪器检测荧光信号强度的变化，基于这些数据，可以确定PCR反应初始的DNA复制数量以及PCR反应最终的DNA复制数量。
总的来说，探针技术的荧光信号可以提供更准确和专业的PCR结果，同时也能够在实时的过程中读取数据。
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荧光定量PCR技术及临床应用
03
疗效评估与预后判 断
荧光定量PCR技术可以实时监测 肿瘤治疗效果，评估患者预后病检测
01
荧光定量PCR技术可以对单基因遗传病进行检测，如地中海贫
血、血友病等。
染色体异常检测
02
通过荧光定量PCR技术，可以检测染色体数目和结构异常，如
唐氏综合征、威廉姆斯综合征等。
自动化程度高
现代荧光定量PCR仪具有高度的自动化特点，能够快速、准确地完成 大量样本的检测和分析，提高工作效率。
局限性
成本较高
荧光定量PCR技术所需的仪 器、试剂和耗材成本较高， 限制了其在资源有限地区的 广泛应用。
操作复杂
样本处理要求高
荧光定量PCR技术操作较为 复杂，需要专业人员操作和 解读结果，增加了技术门槛。
技术改进与创新
提高检测灵敏度和特异性
通过改进PCR反应体系和荧光检测方法，提高荧光定量PCR技术 的灵敏度和特异性，降低检测下限。
自动化与智能化
通过自动化和智能化的技术手段，简化荧光定量PCR的操作流程， 提高检测效率，降低人为误差。
标准化与质量控制
建立荧光定量PCR技术的标准化操作和质量控制体系，确保检测结 果的准确性和可靠性，促进技术的广泛应用和推广。
病原体检测
荧光定量PCR技术在病原体检测 方面具有高灵敏度和特异性，可 应用于各种感染性疾病的诊断和
监测。
肿瘤诊断与治疗
荧光定量PCR技术可应用于肿瘤相 关基因的突变检测、肿瘤细胞耐药 性分析等方面，为肿瘤的诊断和治 疗提供有力支持。
遗传性疾病诊断
荧光定量PCR技术可应用于基因突 变检测、单基因遗传病和染色体异 常疾病的诊断，有助于遗传性疾病 的早期发现和干预。
荧光定量PCR：染料法VS探针法精选全文
可编辑修改精选全文完整版荧光定量PCR：染料法VS探针法实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通过对PCR扩增反应中的每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板的定性及定量分析。
目前它主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
荧光定量PCR，qPCR荧光染料法在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，该染料只与双链DNA 小沟结合，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可以发光，因此，在PCR体系中，随着特异性PCR产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。
EvaGreen、SolisGreen、SYBR染料荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最丨常用的SYBR GreenⅠ,EvaGreen、SolisGreen属于饱和荧光染料。
非饱和荧光染料在浓度高的时候会对PCR过程产生抑制，所以在荧光定量实验时使用浓度稍低，染料不能占据DNA双链上的所有位置。
当PCR随着温度上升，双链逐渐解链，染料会从已解开的单链上脱落，然后结合到临近的尚未解链的双链中去继续发荧光。
这种染料重排导致在较小的温度变化内，虽然DNA双链的解链过程不同，但荧光值是几乎不变的，也就是说，其溶解曲线不能精确反应双链的解链情况。
所以，对于非饱和染料，其溶解曲线分辨率相对较低，只能区分特异性的产物，不能分辨单碱基的差异。
饱和荧光染料在DNA双链中所有可结合位点内都会有染料分子存在，染料与DNA的结合呈饱和状态，随着温度上升，在双链解链、染料脱离过程中，未解链的双链部分不存在染料可以结合的位点，染料不能发生重排。
所以使用饱和染料制作的溶解曲线分辨率很高，可以精确反映DNA双链随着温度的解链情况，精度可以达到单碱差异的区分。
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荧光定量PCR中探针法与染料法的区别：一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述：1.荧光定量PCR探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR扩增的时候，染料结合到DNA上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA都回结合发光。
二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR产物的TM值，缺点就是特异性没有探针法好【分享】定量pcr仪选则宝典:各自精彩的选择如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成，一个是PCR系统，一个是荧光检测系统。
选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR系统来说，重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。
至于荧光检测系统，多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。
荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。
激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。
监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管，前者可以一次对多点成像，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品，需要通过逐个扫描实现多样品检测，对于大量样品来说需要较长的时间。
定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计，这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。
——随着定量PCR技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用，市面上不同品牌和设计的定量PCR仪也不断推陈出新，生物通在这里着重介绍不同的3类定量PCR仪，各有各精彩。
1. 传统的96孔板式定量PCR仪传统的96孔板式定量PCR仪以美国应用生物系统公司(ABI)为代表。
传统96孔板式定量PCR仪的优点是可容纳的样本量大而且无需特殊耗材，可以采用传统的96孔板甚至384孔板进行批量的定量反应，但是缺点也显而易见——温度均一性不佳——平板固定加热模块的PCR温度控制有边缘效应——样品槽上每个孔之间的温度存在差异——也就是所谓位置效应，因此标准曲线的反应条件应难以做到与样本完全一致，样本和样本之间的温度控制也可能存在差异，对于灵敏度极高的定量PCR来说，任何极微小的差异都会以指数级别的规模被放大，不能不说是一种缺憾。
传统反应板面积大，温度控制的精确性、升降温速度也相对较慢，因而反应速度也较慢。
96孔板定量PCR 仪的荧光检测分析系统，由于96孔板上样品孔的位置是固定的，每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同，有可能对结果产生影响。
检测在试管管底进行，试管底的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响。
MJ和Bio-Red公司的定量PCR仪也属于这一类。
ABI的7500型荧光定量PCR仪激发光源为卤钨灯光源，5色滤光镜，可同时激发96个样品，超低温CCD具备同时多点多色检测的能力，能够有效地分辨FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5等荧光染料。
多色荧光检测技术为多重定量、SNP分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。
多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量，可以大大提高精度并节约成本。
随机配置的定量PCR引物和探针设计软件Primer Express非常有用，“因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量PCR所需的TaqMan探针(生物通摘自ABI技术资料)”。
各型号都有实时动态(Real-Time)和终点读板(Plate Read)两种运行模式。
实时动态模式用于定量DNA 或RNA拷贝数。
可以动态显示PCR扩增曲线的生成，定量的线性范围大于9个数量级，区分5000和10000个拷贝的DNA模板可信度达99.7%。
终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性(SNP)分析等。
当然，也可以作为普通PCR仪使用。
ABI定量PCR仪最大的优势在于ABI已经发布十二万种Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因组基因表达分析试剂盒，覆盖人类全部4万个基因，二百万种Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因组SNP 检测试剂盒，为运用7000、7300、7500、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。
ABI 的定量PCR仪均支持两种定量化学：TaqMan荧光探针和SYBR Green I荧光染料。
其熔解曲线(Dissociation Curve)功能用于判断PCR扩增反应是否特异，有无杂带生成。
7500型号比7300多一个滤光镜，新的光路设计使长波长红色荧光的检测灵敏度大大提高，带有快速运行模式。
增强的7900型在96孔模块的基础上更加可以更换384孔版模块，使得高通量处理数据的能力大大增强，应该更适合经常处理大量标本的实验室吧。
MJ的Option系列是在MJ原来的常规PCR仪基础上改造，采用LED光源PMT光电倍增管荧检测器。
96个单色LED光源对应96孔板，但是单色LED激发波长范围较窄。
Option 是单道单个光电倍增管荧光检测器，升级的Option2是双PMT光电倍增管荧光检测器，PMT灵敏度高但一次只能扫描一个样品，所以Option系列是逐孔扫描而非同时检测96个样品。
双PMT可同时进行双色检测(FAM/SYBR Green I;VIC/Joe/TAMRA)。
优势之一是带梯度功能。
Bio-Rad(伯乐)也算是个熟悉的品牌，iCycler iQ实时定量PCR系统也是96孔平板式固定加热的，荧光检测波长范围400-700nm，可4波长同时检测，仪器的设计灵活，定性和定量部分可独立工作，同样可完成梯度PCR。
5组滤光片位置使用户可以自由选择不同的检测波长。
专利技术intensifier荧光放大器保证了极高的检测灵敏度。
MJ被Bio-Rad收购后，Option和iCycler iQ目前还是各自走各自的销售渠道，至于将来Bio-Rad会如何决定二者的发展方向还需要拭目以待。
小中大2.创新概念的离心式实时定量pcr仪为了克服平板式定量pcr温度均一性差的缺点，聪明的研究人员又开发出创新概念的离心式实时定量pcr仪，以roche罗氏的lightcycle和corbett的rotor-gene为代表。
pcr扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样，借助空气加热和转子在腔内旋转，转子上每个孔都是“等位”的，几乎无差别，很好的解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题——corbett的rotor-gene样品间温度差异小于±0.01℃，最大程度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。
利用空气做加热介质的优点在于能实现与反应体系无缝接触，接触面积大且加热均匀。
虽然有竞争对手批评空气介质比热小，但事实上roche的lightcycle%202.0却是目前升温速度最快的定量pcr仪，可以达到20℃/秒!Corbett的Rotor-gene也可以达到5℃/秒(样品实际升温速度达到2.5℃/秒)，优于多数的平板式PCR仪。
借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无需热盖;还可以将酶加在管盖上，升温后离心到管底与反应体系混合，实现“机械的热启动功能”。
由于升温速度快，对于常规需要2个多小时完成的定量PCR反应，Roche的LightCycler仅需20—30 分钟即可完成，可以大大节约时间和提高工作效率。
这一点对于研究人员来说极为有用，因为你不再需要等2个多小时才能看实验结果了，或者换句话来说，2个多小时你可以做4—5轮定量实验了。
由于转子上的样品孔是旋转可移动的，因而离心式荧光检测系统可以固定激发光源和荧光检测器，随时检测旋转到跟前的样品管——由于每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是“等价”一样的，使用的是同一个检测器和激发光源，有效减少不必要的系统误差。
固定的结构使得仪器运行更稳定，使用寿命更长;离心式定量PCR都是逐个检测样品的，所以大多采用了长寿的LED(发光二极管)冷光源，运行前无须预热，无须校正;系统检测重复性也更好。
离心式定量PCR仪的缺点主要是离心的转子小，能容纳的样本量有限，由于是离心式转子，常规的96孔板和条形管就不适用，有的还需要特殊的消耗品，增加使用成本。
当然离心式定量PCR仪不可能带梯度功能。
Roche的Lightcycler刚推出的时候确实让人眼前一亮!现在Lightcycler2.0拥有令人心动的优点-----快速：利用空气动力学原理，20-30分钟内完成30-40个循环。
控温准确：变温速率最高可达20℃/秒，温差≤±0.3°C多波长检测：可同时在530、640及710nm三个通道进行检测，实现同管检测两个项目或设立检测项目的外对照和内对照。
此外动态检测范围达10个数量级，而无须将样品稀释;具有熔点曲线分析功能可以鉴别基因型、检测点突变、检测非特异性扩增，具多种检测模式如Taqman探针、荧光染料SYBR Green I检测、序列特异杂交探针等;探针及引物设计方便，杂交探针及引物设计的限制少，而且亦可方便地选用合适大小的扩增子(100-1000bp)。
但是Lightcycler需要使用特定的毛细管作为样品管，这在某种程度上提高了消耗成本，也不方便作为常规PCR仪使用。
Corbett的Rotor-Gene 也是离心式的定量PCR仪。
在品牌的角度上Corbett当然不如Roche罗氏在国内那样家喻户晓，之所以特别提到这个产品，确实是因为Corbett的设计有独到之处。
比如Corbett的Rotot-Gene3000标准型是真正独立的4通道(可建立新通道)，4个独立LED激发光源(470nm/ 530nm/585nm/625nm)保证最少的光谱交叉(0.99935)。