转基因植物核酸成分检测技术研究进展.kdh

中国生物工程杂志China Biotechnology ，2011，31(1):86-95

转基因植物核酸成分检测技术研究进展

*

邓汉超

1

尹长城

2

刘国振

2，3

林健荣

1

邓平建

1，4＊＊

(1华南农业大学动物科学学院广州5106422北京华大蛋白质研发中心有限公司北京100029)(3河北农业大学生命科学学院

保定071000

4广东省深圳市疾病预防控制中心

深圳518020)

摘要首先对转基因核酸成分检测的靶序列特征进行了阐述，对转基因植物核酸成分的定性、定

量检测技术研究进展进行了综述，

包括基于PCR 的检测技术、基于等温核酸扩增的检测技术、基因芯片检测技术、基于高通量测序和新型转基因核酸检测技术(如生物传感器技术、毛细管电泳技术和纳米刻度技术等)，重点介绍了各种检测技术的原理、特点、研究现状和发展动态，并对各种方法的优缺点进行了比较。关键词

转基因核酸成分

PCR 核酸等温扩增基因芯片生物传感器

中图分类号

Q789

收稿日期:2010-09-03修回日期:2010-10-19*国家科技支撑计划(28-1001KJZD-1)、国家转基因生物新品种培

育重大专项(2009ZX08001-023B )资助项目＊＊通讯作者，电子信箱:szdpj2002@163．com

近年来，由于转基因技术的发展和应用，大批转基因植物新品种不断涌现。据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA )统计，截至2009年全世界转基因作物种植面积为1．34亿公顷，较上年增幅达7%，转基因植物的种植国家也从1996年的6个增至25个，全球种植面积增加了80倍

［1］

。转基因作物的大量种植和推广

同时对转基因生物的检测技术提出了要求，发达国家的转基因及相关检测技术远远超过发展中的国家。美国、加拿大等国已有近百种转基因食品上市，并且他们的目标是把大量的转基因食品出口到发展中国家。除这些正式获批进行生产和贸易的产品外，还有数目众多的品种处于试验阶段或未经正常手续进入了市场，我国已经加入WTO ，正在面临着转基因产品贸易和安全监测的挑战。

随着商品化转基因生物种类的不断增加，转基因生物本身的安全性以及它们对人类健康和生态环境的潜在威胁已经成为国际社会和广大民众广泛关注的热点问题之一。包括我国在内的越来越多的国家制定并实施了转基因食品的强制标识制度。因此，转基因产品的科学管理和应用需要得到转基因产品及其成分检测技术的支持。目前，转基因产品及成分检测最常用

的方法有两类:一类是针对其外源核酸成分的检测技术

［2-5］

;另一类是针对其外源蛋白质成分的免疫学分析方法

［6-7］

。转基因植物外源蛋白质，即外源基因所表达

的蛋白质占总蛋白质含量低，故难以检测，加之蛋白质经加工处理后其原有的性状会有所改变，因此针对外源蛋白质的ELISA 等免疫学分析技术受到了很大限制。相对而言，核酸的稳定性要高于蛋白质，因此针对核酸成分的检测技术成为转基因成分检测的首选。本文试图对转基因植物核酸成分检测的定性及定量检测技术，包括基于PCR 的检测技术、基于等温核酸扩增的检测技术、基因芯片检测技术、基于高通量测序和其他新型转基因核酸检测技术(生物传感器技术、毛细管电泳技术和纳米刻度技术)进行综述，介绍其原理、特点、研究现状和发展动态。

1转基因植物核酸成分检测的靶序列

根据所检测转基因核酸成分的靶序列的位置和序

列的特征，将检测方法分为核酸成分筛查、基因特异鉴定、T-DNA 特异鉴定以及转化事件特异鉴定4类方法

［8］

，各方法扩增的元件和序列特征如图1所示。

核酸成分筛查法以转基因产品所导入外源基因的通用调控元件或基因为扩增的靶序列，通过对这些通用元件和基因的鉴定完成转基因生物的筛查。转基因产品通用的调控元件包括启动子和终止子，如CaMV

2011，31(1)邓汉超等:转基因植物核酸成分检测技术研究进

展

图1几种PCR方法对应的扩增序列

Fig．1Several PCR methods corresponding

to the amplification of sequences

35S启动子、CaMV35S终止子、T-nos终止子，常见的通用基因则包括bla、hpt、nptII等标记基因和报告基因。通用序列普遍存在于转基因产品中，可作为筛查样品是否含转基因DNA成分的标志物。在大规模的样品筛查时，检测通用序列能节省时间、减少工作量，提高效率。但由于这些基因在自然环境中存在，在PCR扩增检测转基因产品时很容易受到污染而出现假阳性结果。因此此方法检测转基因DNA成分的特异性较差，只适合作为转基因产品的初步筛查。

基因特异鉴定法扩增检测的靶序列为所导入的外源基因的DNA序列。不同的转基因产品，往往含有不同的外源目的基因，因此外源目的基因序列可作为PCR扩增鉴定样品含何种转基因DNA成分的标志物。

T-DNA特异鉴定法又称插入DNA检测法，其靶序列为来自转基因产品所导入的T-DNA(transfer DNA)序列。T-DNA内含的外源基因、调控序列和载体序列的连接方式取决于所构建的转化质粒分子。显然，以T-DNA内含基因间的边界序列作为标志物鉴定样品含何种转基因DNA成分，其特异性显然要高于基因鉴定法。

转化事件特异鉴定法的扩增检测的靶模板来自转基因产品所导入的T-DNA与受体植物基因组间的边界序列。现已了解，即便是采用相同的转化质粒载体，经同一次转化事件所获得的各个转基因植株，其所导入的T-DNA在受体植物基因组的插入位点也不可能完全相同。所以，以T-DNA与受体植物基因组间的边界序列作为标志物不仅可以特异地鉴定样品含何种转基因核酸成分，还可以鉴定出样品所含的转基因DNA成分来自何种品系和株系。因此，在转基因核酸成分的普通PCR检测技术中，转化事件特异鉴定法的特异性最高。正是基于这一特性，该方法已被广泛用于转基因产品DNA成分的鉴定和溯源检测。2基于PCR的检测技术

2．1定性PCR检测技术

定性PCR检测技术的检测策略是以PCR扩增技术为核心，经扩增后的产物进行凝胶电泳检测靶目标DNA。基于PCR扩增的检测技术，其灵敏度高、特异性强，因此该技术被普遍应用于转基因成分的检测。其中，针对不同的靶DNA设计不同的特异性引物，经PCR扩增和凝胶电泳检测靶DNA的普通PCR (conventional PCR)检测技术，能实现对不同转基因核酸成分的特异性扩增和鉴定。

普通PCR扩增技术虽然具有很高的灵敏性，但对于量少和受到严重破坏的核酸样本，也显得无能为力。例如，深加工食品，其DNA遭受比较严重的破坏，再加上转基因DNA成分受到大幅度的稀释，采用普通PCR 往往难以检测食品中转基因DNA成分，因此提高PCR 检测灵敏度对能否准确标定食品是否含有转基因成分尤为关键。目前，在分子生物学和医学领域得到广泛应用的巢式和半巢式PCR(nested and semi-nested PCR)检测技术，针对同一模板，利用两对引物，两次特异扩增，既可提高鉴定的特异性，又可提高检测的灵敏度，因此，在转基因植物产品检测中也得到了应用。例如，黄昆仑等［9］运用巢式和半巢式PCR检测食品原料和深加工食品中含有的转基因DNA时发现，巢式PCR 可以提供更好的灵敏度和重现性，特别是对因加工受损的DNA片段检出，表现良好。

由于商品化转基因生物的种类不断增加，所涉及的基因也不断的增多，普通PCR检测技术一次反应仅能针对一个目标序列难以满足现行转基因成分快速检测的需求。而在同一个反应管里进行两对或两对以上的引物针对不同的DNA序列进行PCR扩增的多重PCR(multiplex PCR)检测技术，与普通PCR相比，具有同时检测多个不同的DNA序列提高检测通量的显著特点，具有较好的应用前景。Matsuoka等［10］利用多重PCR实现了对5个转基因玉米品系(Event176、BT11、T25、MON810及GA21)DNA成分的同时检测，检测灵敏度达0．5%，适合转基因成分的检测和食品的标识监测。Forte等［11］建立了针对Lectin、Zein、Nos终止子和35S启动子的多重PCR检测体系，用于快速高效筛查转基因大豆和玉米。敖金霞等［12］将多重PCR和巢式PCR结合应用，建立了可同时检测Cry1A(b)基因、BAR 基因、CP4-EPSPS基因、PAT基因及共同的内标准基因

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