聚赖氨酸研究进展 PPT课件

聚赖氨酸研究进展
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目录
1 前言 2 聚赖氨酸概述 3 市场概况
4 国内外研究现状 5 发酵调控工艺优化 6 分离与提取工艺优化
一 前言
• 全世界每年约有10％～20％的农副产品、水产品、果蔬会 腐败变质，经济损失巨大。
• 食品的腐败变质主要是指由于微生物的作用而导致食品质 量下降或失去食用价值的一切变化，它直接影响食品的品 质和消费者的健康。
② 贾士儒[26] 等根据 ε-PL 分子质量大小开发了一种利用多级膜分离 技术纯化 ε-PL 的方法，获得了分子质量分布在 2 ～ 5 kDa 的 εPL;
③ 周斌[27] 等建立了离子交换树脂和膜浓缩技术相结合的方法用于 εPL 的提取。
2 ε-PL 提取工艺路线的初步建立
ε-PL 各项参数指标：
➢ ε-聚赖氨酸的发酵生产 筛选聚赖氨酸产生菌株，并利用其进行发酵生产聚赖氨酸。
7 ε-聚赖氨酸产生菌的筛选
• 2002年，Nishikawa和Ogawa[6]研究出一个高效简便的ε-PL 产生菌株筛选方法：在传统的平皿中添加浓度为0.02%的 酸性染料Poly-R-478，通过Poly-R-478与ε-PL的相互作用， 使得产ε-PL菌落周围的Poly-R-478浓缩并产生颜色变化， 从而鉴定出产生菌株。
[3] Shima S, MATSUOKA H, IWAMOTO T, et al. Antimicrobial action of. EPSILON.-polyL-lysine[J]. The Journal of antibiotics, 1984, 37(11): 1449-1455.
[4] Vaara M, Vaara T. Polycations sensitize enteric bacteria to antibiotics[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1983, 24(1): 107-113.
⑪ 曾昕[24]等研究了葡萄糖和甘油作为混合碳源时对于提高ε-聚赖氨酸产量的作 用，表明混合碳源可以加速细胞的生长以及代谢产物的合成，从而提高ε-聚 赖氨酸的生产率。
六 ε-PL分离与提取工艺优化
1 ε-PL分离与提取工艺研究进展
① 莫树平[25]等研究了离子交换树脂种类和洗脱条件，筛选到了国产 大孔弱酸性阳离子树脂 D113 和 HD-2，并建立了相应的工艺条件。
Streptomyces sp. GIM8. D152
发酵时间 聚赖氨酸产量
（h）
(g/L)
生产强度 g/L/h
72
2.95
0.041
80
6.65
0.083
88
34.11
0.388
168
35.1
0.209
200
23.4
0.117
人物 姜俊云[11] 朱宏阳[12] 张扬[13] 陈旭升[14] 刘胜荣[15]
③ 刘胜荣[15]等为了解除产物抑制，筛选了具有高的 ε-PL 吸附能力和解吸附能 力的弱酸性阳离子交换树脂，将该策略应用到发酵罐上，发酵 8天，产量为 23.4 g/L。
④ 2010 年，张扬[13]等利用丝瓜囊对 ε-PL 产生菌进行固定化培养，实现了菌体 的重复利用，同时使得 ε-PL 产量达 34.1 g/L，日产率达9.34 （L·d）。
6 聚赖氨酸的生产方法
➢ 聚赖氨酸的化学合成 聚赖氨酸的化学合成是在1947年首先完成的，化学法合成的聚赖 氨酸为α型，其赖氨酸残基之间的酰胺键是有α-氨基和α-羧基缩合 而成[2] 。
➢ ε-聚赖氨酸的生物合成 由L-赖氨酸聚合酶催化单体赖氨酸聚合而成，所以ε-聚赖氨酸的 代谢途径可能经赖氨酸合成途径，最后由聚合酶催化合成。
⑨ 孙启星[20]等通过在线监控pH的基础上，通过种子阶段孢子预处理与接种量的 优化，在5 L发酵罐中发酵186 h，产量达到48.9 g/L。在50 L 发酵罐中发酵186 h，产量达到了36.22 g/L。
⑩ 任喜东[21，22，23]等利用农副产品生产ε-聚赖氨酸，产量达到了35.24 g/L。随后 又采用在补料分批发酵中酸性pH冲击策略使产量提高至54.7 g/L，并对其产ε聚赖氨酸反应机理进行研究。
国内 ε-聚赖氨酸发酵工艺优化
① 姜俊云等[11]主要研究了 pH、搅拌转速、碳源流加方式对菌体生长和 ε-PL 合 成的影响。试验结果表明，在 5 L 发酵罐中，当 pH 为 4.0、搅拌转速 350 r/min、碳源流加方式为变速流加时，得到了 6.93 g/L 的 ε-PL 。
② 朱宏阳等[12]优化了通风量、pH 和转速，最后经过优化补料方式，ε-PL 的产 量达 13.9 g/L，是出发菌株原始产量的近 20 倍。
⑤ 董难[17]等人从碳源和氮源补料方式的优化入手，建立了流加谷氨酸发酵策 略和补料酵母粉发酵策略。在发酵过程中流加谷氨酸 174 h 实现 ε-PL 产量 达到了 31.65 g/L，比对照的 ε-PL 产量（21.22 g/L）提高了 49.2%。
⑥ 2010年，陈旭升[14] 通过研究碳源和氮源流加方式对 ε-聚赖氨酸补料-分批发 酵过程的影响，将补料阶段甘油浓度稳定控制在 0 ～10 g/L，并在发酵 96 h 开始流加酵母粉和( NH4)2SO4混合液，结合 pH 值 2阶段调控策略( 3. 5→3. 8) ，经过192 h 发酵，可以实现 ε-PL 产量达到38. 77 g/L，产率达到4. 85 g/( L·d)。
人工合成 化学防腐剂
危害
限制 条件
苯甲酸、苯甲酸钠、 山梨酸、山梨酸钾、
丙酸钙等
天然 防腐剂
精蛋白，蜂胶，壳聚糖， 茶多酚，香精油，聚赖
氨酸等
二 聚赖氨酸概述
1 聚赖氨酸的理化性质
ε-聚赖氨酸纯 品为淡黄色粉 末、吸湿性强， 是赖氨酸直链 状聚合物，聚 赖氨酸聚合度 一般为25-30， 结构图如下：
3 聚赖氨酸的功能和作用
① ε-聚赖氨酸在保鲜防腐方面的应用 ② ε-聚赖氨酸在医学方面应用 ③ ε-聚赖氨酸在生活方面应用 ④ 乳化剂 ⑤ 食疗剂
4 ε-聚赖氨酸测定方法
① 分光光度法测ε-聚赖氨酸含量 采用甲基橙与ε-聚赖氨酸在一定条件下结合，产生沉淀
，通过比色法测出未与ε-聚赖氨酸结合的甲基橙含量，进一 步可得到聚赖氨酸浓度。通过这种比色分析法可检测到低至 10-6 mol/L浓度[1]。 ② 高效液相色谱法测定聚赖氨酸的含量
四 聚赖氨酸的国内外研究进展
聚赖氨酸的国外研究进展
菌种
发酵时间 聚赖氨酸产 生产强度
人物
时间
（h）
量
g/L/h
S.albulus 346
—
4~5 g/L
—
Shima [7,8]
1981
B21021
168
31 g/L
0.185
岩田敏治[9]
1997
Lysinopolymerus
96
346
S.albulus 410
③ Kahar [2]等人先将发酵 pH维持在 5.0 以上一段时间，累积菌体量；然后将 pH 降至 4.0 左右高速合成 ε-PL。在补料时期，控制发酵液中葡萄糖浓度为10 g/L， 最终使S. albulus S410的产量达到了48.3 g/L。
④ Hiraki 和 Suzuki[16]将固定化技术用于白色链霉菌来降低 ε-PL 发酵成本。他们 选用了凝胶和多孔陶瓷作为固定化材料，虽然没能提高产量，但最终达到了 降低成本的目的。
⑦ 许召贤[18]等通过在培养基中添加 0.5%的正十二烷来提高溶解氧，从而达到提 高ε-聚赖氨酸产量的目的，168 h，产量达到30.8 g/L。
⑧ 周永鹏[19]等通过对出发菌株进行原生质体融合，得到一株重组菌株F4-22，在 5 L酵罐中发酵163 h，产量达到了39.96 g/L，比菌株M-Z18（30.11 g/L）提高 了32.7%。
• 白色链霉菌，诺氏链霉菌，弗吉尼亚链霉菌，麦角真菌
三 聚赖氨酸的市场概况
之前，世界赖氨酸市场主要由日本味之素公司、美国 ADM公司、德国巴斯夫公司、日本协和发酵公司和韩国希 杰公司等控制，目前，日本年产数千吨左右，在满足国内 食品行业大量需求外，产品还销往美国、欧洲、韩国等国 家。近年来，我国的赖氨酸生产企业迅速崛起，在世界竞 争中占据了一席之地。
ε-聚赖氨酸遇酸性多糖类、 盐酸盐类、磷酸盐类、铜离 子等可能因结合而使活性降 低。与盐酸、柠檬酸、苹果 酸、甘氨酸和高级脂肪甘油 酯等合用又有增效作用、分 子量在3600-4300之间ε-聚赖 氨酸抑菌活性最好，当分子 量低于1300时，ε-聚赖氨酸 失去抑菌活性。
2 聚赖氨酸的生物学性质
① 安全性高 ② 抑菌范围广 ③ 最适pH值 ④ 热稳定性好 ⑤ 在水中的溶解性极强
测定ε-PL 的方法是高效液相色谱法(HPLC)，波长为UV 215 nm检测，洗提液0. 1% H3P04，流速0. 4 ml/min [2] 。
5 ε-聚赖氨酸的抑菌机理
• 传统研究认为，食品防腐剂的作用机理主要表现在如下3 个方面：
• (1) 作用于细胞壁和细胞膜系统； • (2) 作用于遗传物质或遗传微粒结构； • (3) 作用于酶或功能蛋白。
[5] Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membrane[J]. Microbiological reviews, 1992, 56(3): 395-411.
[6] Nishikawa M, Ogawa K. Distribution of microbes producing antimicrobial ε-poly-L-lysine polymers in soil microflora determined by a novel method[J]. Applied and environmental microbiology, 2002, 68(7): 3575-3581.
168
20 g/L 48.3 g/L
0.208 0.288
Hiraki [10]
1998
Kahar [2]
Biblioteka Baidu
2001
聚赖氨酸的国内研究进展
菌种
S.albulus DM1
Kitasatospora sp. PL6-3
Kitasatospora sp. MY 5-36
Streptomyces sp. M-Z18
[7] Shima S, Sakai H. Poly-L-lysine produced by Streptomyces. partⅡ taxonomy and fermentation studies[J]. . Agric Biol Chem, 1981, 45(11): 2497-2502.
[2] Kahar P, Iwata T, Hiraki J, et al. Enhancement of ε-polylysine production by Streptomyces albulus strain 410 using pH control. J Biosci Bioeng, 2001, 91:190-194.
➢ ε-聚赖氨酸 总收率：51.2% ➢ 蛋白去除率：98.8% ➢ 氯含量：19.1% ➢ 灰分：3.2% ➢ 蛋白含量：2.5% ➢ 产品纯度：88.6% ➢ 聚合度：28.4
参考文献：
[1] Itzhaki R F. Colorimetric method for estimating polylysine and polyarginine[J]. Analytical biochemistry, 1972, 50(2): 569-574.
• Shima S[3]等研究发现，防腐剂主要抑制微生物的呼吸作用，导致 能量物质ATP和还原物质NADH亏缺，所有合成代谢受阻，活性 的动态膜结构不能维持，代谢方向趋于水解,最后产生细胞自溶。
• 1983年，Vaara M[4]等发现聚阳离子能破坏G- 细菌的外膜，并进一 步杀死这些细菌。
• 1992年Vaara M[5]进一步发现,聚赖氨酸是通过吸附到G- 细菌的外膜 上，释放出大量的脂多糖，破坏细菌外膜，而起到抑菌作用的。
时间
2004 2005 2010 2010 2011
五 聚赖氨酸的发酵工艺优化：
国外 ε-聚赖氨酸发酵工艺优化
① Shima [8]在洗涤过的菌体中加入培养基，调 pH 值为酸性，ε-PL 产量达 4-5 g/L。
② 岩田敏治等 [9]在 Hiraki 试验方法的基础上，增加了自动流加碱液控制发酵液 pH 的技术，发酵 7 天时产量达 30 g/L 左右。