非生物及生物胁迫下脱水蛋白研究进展

•在线工具
•http://prdos.hgc.jp/cgi-bin/top.cgi
2 NtDHN17蛋白生物信息学分析
小结
NtDHN17蛋白是一个Y2SK2类中性脱 水蛋白 NtDHN17蛋白二级结构以无序卷曲 为主 NtDHN17蛋白是一个高度亲水的无序 蛋白
3 NtDHN17蛋白功能初步研究
非生物及生物胁迫下脱水蛋白 研究进展
Progress in Research of Dehydrins Response to Abiotic and Biotic Stresses
非生物及生物胁迫下脱水蛋白的研究进展
1
无序结构的脱水蛋白 与大分子结合的脱水蛋白 与小分子结合的脱水蛋白
2
3
4
参与生物胁迫的脱水蛋白
TCA-element
TGACG-motif
水杨酸响应元件
茉莉酸响应元件
4
3
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析
小结
RACE - contig1045 - NtDhn17 NtDhn17基因在正常生长植物体内存 在本底表达 NtDhn17基因受ABA；自然干旱和高 渗胁迫；JA和SA；过氧化氢；微生 物代谢产物（DMP）上调表达
无序蛋白的基本特征
• 以无序卷曲的形式存在于水溶液中
二级结构名称 α-螺旋 β-折叠 γ-转角 无序卷曲 Total
占肽链的百分百 (%) 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
无序蛋白的基本特征
• 高温处理不发生沉淀
无序蛋白热稳定性分析 MpASR热稳定性分析
BSA BSA (-) (+)
MpASR MpASR
无序蛋白 vs 蛋白变性聚集
94.0kDa 66.2kDa 45.0kDa
M
(-)
(+)
35.0kDa 24.0kDa
14.4kDa
BSA(-)表示未经100℃热处理的BSA蛋白； BSA(+)表示经100℃热处理30分钟的BSA蛋白； MpASR(-)表示未经100℃热处理的MpASR蛋白； MpASR(+)表示经100℃热处理30分钟的MpASR蛋白。
NtDHN17蛋白
生化性质 无序性
研究方法
高温诱导变性沉淀 胰蛋白酶敏感实验
亲水性
蛋白聚集沉淀实验
3 NtDHN17蛋白功能初步研究
NtDHN17蛋白无序结构验证-热稳定性
热聚集实验表明NtDHN17蛋白具有无序蛋白 典型特征，在高温处理后不发生聚集沉淀； 与锌离子结合后，获得高级构象，失去了 无序蛋白在高温条件下保持水溶性的特征。
脱水蛋白相关背景
LEA蛋白-第2组
-1980s，第一次报道脱水蛋白
-Late embryogenesis abundant protein, 第2组
三个保守片段
-Y，S和K片段
-5个亚类(Kn、SKn、KnS、YnKn和YnSKn )
脱水蛋白相关背景
碱性或酸性 干旱&ABA 酸性 低温&干旱 酸性或中性 低温 酸性 干旱&低温 酸性 低温
无序蛋白的基本特征
• SDS-PAGE电泳迁移率较小 • 对蛋白酶高度敏感 • 结构柔韧，可在无序与有序间变换
无序蛋白的生物学优势
• 易结合性：由于无序结构呈线状延伸，使得它很容易被其 他分子所识别和结合；可以在较大范围内与其他蛋白质或 大分子结构结合，其功能位点能够高效的与其他大分子进 行结合和组装
参与生物胁迫的脱水蛋白
参与生物胁迫的脱水蛋白
小结
• 脱水蛋白在非生物胁迫过程中发挥重要作用，具有 多种功能。有些脱水蛋白可能同时发挥多种功能， 而一些脱水蛋白只能发挥单一功能。
• 结合酸性磷酸脂、离子和抗冻保护能力被认为是脱 水蛋白的基本功能。
• 逆境胁迫和病害是影响植物生长发育的一个重要因 素，深入研究脱水蛋白在非生物胁迫和生物胁迫中 发挥的确切功能不仅有助于更全面的了解植物应对 逆境胁迫的机制，还能为开发脱水蛋白在作物改良 中的应用奠定理论基础。
植物与非生物逆境胁迫
植物与非生物逆境胁迫
膜脂相变 排列紊乱 形成孔隙 脂质过氧化 疏水基团外翻 从膜上脱落
流动性降低 膜脂、蛋白解体 细胞内容物外漏 离子、渗透平衡破坏
第一个脱水蛋白的发现
1989年
ABA处理 的大麦胡 粉粒
&
干旱处理 的玉米幼 苗
4个干旱诱 导蛋白
脱水蛋白 Dehydrin
植物应对逆境胁迫的代谢和分子基础
博士后期间工作
研究目的、意义及研究路线
•烟草是重要的经济作物，是云南省财税的重要经济来源。 •干旱等自然灾害给烟草等经济作物的生产造成了重大的损失。
•探索抗旱等非生物胁迫相关基因资源并阐明其功能对经济作物的生长 及财政收入有着重要的战略意义及广阔的应用前景。
•脱水蛋白响应植物体内多种造成生理性干旱的胁迫 •具体功能未知 •优良的候选基因
Dehydrin
•烟草Annotations Nicotiana tabacum Genbank 050206 •2个注释为脱水蛋 白基因克隆 •contig1045 •contig9354
•RACE
•自然干旱处理 •克隆到contig1045 基因 •编码蛋白-17kDa •NtDhn17
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析
与小分子结合的脱水蛋白
• 水分胁迫可能引起从细胞器或膜上释放金 属离子，从而导致细胞内自由金属离子浓 度增大，而脱水蛋白与金属离子的结合可 以减轻由自由离子造成的伤害——金属离 子结合性 • 分离得到的玉米胚的Rab17蛋白是磷酸化形 式的，这是第一次报道脱水蛋白的磷酸 化 ——与磷酸基团结合性
与小分子结合的脱水蛋白
2 NtDHN17蛋白生物信息学分析
NtDHN17二级结构预测
•二级结构以无序卷曲为 主 •在线工具
•HNNC、MLRC、PHD和 Predator
2 NtDHN17蛋白生物信息学分析
•NtDHN17蛋白由169个氨基酸组成 •为Y2SK2类脱水蛋白
•NtDHN17(MW):17,773Da •MtDHN(pI):6.81
contig1045片段的获得
contig1045克隆的cDNA全长及编码蛋白序列
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析 表达谱分析
DMP,青霉菌灭活菌丝体,微生物代谢产物,植物系统抗病性诱导剂
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析 启动子分析 启动子序列克隆-热不对称PCR
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析 启动子分析
• NtDHN17亚细胞定位——细胞核
3 NtDHN17蛋白功能初步研究
原核表达获得体外重组NtDHN17蛋白
200kDa 100kDa
50kDa
30kDa 25kDa
IPTG浓度
诱导时间
过柱纯化
预测大小：17.7kDa SDS-PAGE：~25kDa 无序蛋白特征之一：迁移率
3 NtDHN17蛋白功能初步研究
YSK类脱水蛋白保守结构域比对
2 NtDHN17蛋白生物信息学分析
NtDHN17蛋白氨基酸序列分析
•Gly 21.3%,亲水值 >1 •NtDHN17蛋白是亲水素 •在线工具
•http://www.vivo.colostate.edu/molkit/ hydropathy/index.html
NtDHN17蛋白无序性预测 •NtDHN17是无序蛋白 •80%氨基酸序列为无序结构
• 值得引起注意的是，SA和JA通常与植物抗生物胁 迫相关 • 同时，Turco等人发现在抗旱栎树Quercus ilex受 到疫霉菌Phytophthora cinnamomi侵染时，会表达 若干个类脱水蛋白 • 这些实验结果均表明，除了参与水分胁迫外，脱 水蛋白还可能与生物胁迫相关
参与生物胁迫的脱水蛋白
DHN(-)表示未经热处理的NtDHN17蛋白； DHN(+)表示经100℃热处理30分钟的NtDHN17蛋白； DHN-Zn2+(+)表示与锌离子结合后热处理ຫໍສະໝຸດ Baidu0分钟的NtDHN17蛋白； BSA(-)表示未经热处理的BSA蛋白； BSA(+)表示经100℃热处理30分钟的BSA蛋白； BSA-Zn2+(+)表示与锌离子结合后热处理30分钟的BSA蛋白；
启动子顺式作用元件分析及表达活性检测
顺式作用元件名称 ABRE ATCT-motif BoxI BoxIII Box-W1 CGTCA-motif G-Box GARE-motif HSE MBS TC-rich repeat 可能的功能 响应ABA 光响应元件 光响应元件 蛋白结合位点 真菌激活子响应元件 茉莉酸响应元件 ABA响应元件 赤霉素响应元件 分子伴侣结合元件 干旱响应元件 生物胁迫响应元件 出现频率 2 1 1 1 2 3 4 2 2 3 3
• 各种逆境胁迫还会引起活性氧的积累 • 活性氧首先是对生物膜系统造成损伤，导致细胞膜过氧化， 超氧化物歧化酶和其他清除自由基的酶类活力下降，同时 产生大量的膜脂过氧化产物，破坏膜脂的完整性和稳定性； 膜系统的破坏会引起一系列生理生化紊乱。ROS还对生物 大分子如蛋白质和核酸造成氧化损伤 • 脱水蛋白具有与活性氧分子结合的能力，对柑橘 CuCOR19蛋白的研究表明，CuCOR19蛋白能特异结合羟 基自由基和过氧化自由基的能力，羟基自由基作用的靶位 点主要是Gly、His和Lys，而脱水蛋白中富含这些氨基酸， 因此脱水蛋白可能在活性氧爆发的情况下通过自我牺牲的 方式消耗活性氧从而保护其它蛋白质免受损伤
• 脱水蛋白具有活性氧结合与清除能力
与小分子结合的脱水蛋白
• 脱水蛋白还可以与水分子结合
• 在水分胁迫细胞中维持水分，维持渗透压 • 保护蛋白在细胞内离子平衡打破时不发生 变性
脱水蛋白可能发挥功能示意图
参与生物胁迫的脱水蛋白
• 不同的研究小组发现，水杨酸(SA)和茉莉酸(JA) 可以诱导特殊的脱水蛋白如厚叶旋蒴苣苔的 BcDh2表达
• 空间优越性：无序结构可以节省空间，未折叠多肽在细胞 中所占据的空间与具高级结构的大分子相比要小的多；当 多个蛋白质同时结合于某一位点时，无序结构可以使这种 结合更紧密；同时还有利于完成互作后，不同成分的转换
• 高度协调性，大范围、多组分的互作结合需要高度的协调， 无序蛋白中所含的多个重复结合基序可以有效地协调蛋白 间的相互作用，使得大分子的组装与分解更加高效
与大分子结合的脱水蛋白
• 利用哺乳动物纤维母细胞筛选系统的研究表明拟 南芥ERD10与COR47是与细胞骨架互作的蛋白
• ERD10可以直接与肌动蛋白微丝结合，抑制肌动 蛋白聚合 • 磷脂质，核酸和细胞骨架这一类的大分子是细胞 遭受胁迫时比较敏感的大分子。对脱水蛋白的研 究表明，与这些大分子的结合可能是脱水蛋白在 植物细胞遭受胁迫时发挥保护功能的关键
• 小麦脱水蛋白DHN-5异源表达于拟南芥中 时，不仅可以帮助植物抗水分胁迫，还具 有多重抗胁迫功能 •
参与生物胁迫的脱水蛋白
• DHN-5异源过表达还影响了茉莉酸(JA)信号通路
• 茉莉酸ZIM结构域(JAZ)家族三个成员，JAZ10、 JAZ7和JAZ5均下调表达2.5至10倍不等 • 病程相关蛋白家族的PR1、PR13和PR14的转录分 别上调2、2.6和3.38倍 • DHN-5转基因株与野生型相比更加耐受JA的处理
与大分子结合的脱水蛋白
• 脱水蛋白高度保守结构基元——K片段可以形成 双亲性α-螺旋，与大分子膜脂结合
• 利用去垢剂，可以从膜碎片小泡中分离到脱水蛋 白 • 氨基端的Y-片段含有核酸结合结构域，因此脱水 蛋白还可能与核酸结合
• 柑橘脱水蛋白CuCOR5具有锌离子依赖的核酸结 合功能
• 与核酸的结合不是脱水蛋白的保守功能
研究目的、意义及研究路线
研究 目的
脱水蛋白在烟草逆境胁迫响应 过程中发挥的生物学功能
研究 意义
研究脱水蛋白在胁迫应答过程 中发挥的生物学功能，不仅能 增加对植物抗逆机理的了解， 还可为作物改良提供候选基因， 具有研究和应用价值
研究目的、意义及研究路线
研究路线
1 烟草脱水蛋白基因克隆及表达谱分析
无序结构的脱水蛋白
• 缺乏有序的高级结构是脱水蛋白最基本的 生化特征之一 • 脱水蛋白富含甘氨酸、带电荷氨基酸和极 性氨基酸 • 大部分脱水蛋白不含有半胱氨酸残基或其 他疏水结构域
无序结构的脱水蛋白
无序蛋白
• 无序蛋白——生理状态或天然状态下没有特定高级结构的 蛋白质总称， • 约占真核生物总蛋白的1/3 • 细胞内的无序蛋白可以分为完全无序蛋白和部分无序蛋白 • 无序蛋白的发现是对经典的“结构-功能”范式的挑战 • 无序蛋白灵活易变，有与多种底物结合的潜能，是细胞中 的高效部队，是目前蛋白质组学研究中的重点与热点