3 基因组作图

一、 遗传图谱（genetic map）
3、遗传作图的方法
一、 遗传图谱（genetic map）
3、遗传作图的方法
有性杂交实验 之 三点测交 例：果蝇 X 连锁的三个突变基因 ec, sc, cv
ec + + ec sc cv
+
sc
cv
♀
×
♂
杂合雌蝇（ec + +/+ sc cv）与隐性雄蝇（ec sc cv/Y）杂交
二、 物理图谱（physical map）
用分子生物学方法直接检测DNA标记在染色
体上的实际位置绘制成的图谱称为物理图谱。
有遗传图谱为什么还要构建物理图谱？
二、 物理图谱（physical map）
遗传图谱的缺陷：
分别率有限。人类只能研究少数减数分裂事件， 不能获得大量子代个体。
覆盖面较低。经典遗传学认为，交换是随机发生 的，但基因组中有些区域是重组热点；倒位、重 复等染色体结构变异会限制交换重组
1.1 限制性酶切作图的原理 二
1
A
wk.baidu.com
3
B
6
完全酶切
A
1 9
B
4 6
A+B
1 3 6
不完全酶切
1 4 1 3
9 6 6
两酶切点之间的片段为重叠的片段
二、 物理图谱（physical map）
1.2 部分酶切法测定DNA片段位置
①完全降解：获得完全酶切片段的数目和大小 的图谱。 ②部分降解：避免所有切口断裂的完全降解发 生。部分酶解产物同样进行电泳分离及自显影。 ③比较上述二步的自显影图谱,根据片段大小及 彼此间的差异即可排出酶切片段在DNA链上的位置。
一、 遗传图谱（genetic map）
1、遗传标记
遗传标记的特征


个体间存在着多态性（即差异），也就是
该多态性在后代中可以重演，即具有可遗
说具有可识别性。 传性。
一、 遗传图谱（genetic map）
2、遗传作图的基础
连锁分析是遗传作图的基础。
在同一条染色体上的基因间表现出遗传连锁 部分连锁与重组：减数分裂时同源染色体发生交换； 两个彼此靠近的基因之间因交换而分离的频率，要比相 互远离的两个基因之间发生分离的频率要小。 重组率可成为测量基因之间相对距离的尺度，只要获 得不同基因之间的重组率，就可绘制一份基因位于染色 体上相对位置的地理图
通过计算连锁的遗传标记之间的重组频率， 确定它们的相对距离，一般用厘摩(cM，即减数 分裂的重组频率为1%)来表示。
一、 遗传图谱（genetic map）
1、遗传标记
遗传图有特征性的位置标记，用于表示基因组 中特定顺序所在的位置。
遗传标记的类型
基因标记 形态标记、细胞学标记、生化标记 DNA标记 RFLP、微卫星、SNP
YAC载体的平均装载量为600 kb， 改进的操作程序可插入1400kb的片段
TEL
BamHI TEL
二、 物理图谱（physical map）
1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线
黏粒（cosmid） cosmid，也称黏粒、柯斯载体， 是人工构建的含有λ噬菌体 DNA的cos序列和质粒复制子的 特殊类型的质粒载体。
染色体上的基因和DNA顺序均可 基 因 组 路 标
标记3 标记1 标记2
作为路标，路标具有物理属性，
他们由特定的DNA顺序组成。 路 标位于染色体上的位置是固定的， 具有唯一性，不会更改的，因而 提供了作图的依据。
一、 遗传图谱（genetic map）
遗传图谱的概念
采用遗传分析的方法将基因或其它DNA序列标定 在染色体上，得到的线性排列图称为遗传连锁图， 简称遗传图。
第3章
基因组作图
人类基因组四张图谱
为何要绘制遗传图与物理图？
基因组计划的主要任务是获得全基因组 序列，基因组太大，必需分散测序，然 后将分散的顺序按原来位置组装，需要 图谱进行指导 。 基因组存在大量重复顺序，会干扰排序， 因此要高密度基因组图。
遗传图和物理图各有优缺点，必须相互 整合校正。 基因组计划的第一个环节--构建基因组图谱
一、 遗传图谱（genetic map）
2、遗传作图的基础
基因间交换（去连锁）的概率与它们在 染色体上的距离成正比例。因而重组频率是 衡量两个基因间距离的单位。
少数例外：重组热点区域
一、 遗传图谱（genetic map）
3、遗传作图的方法
有性杂交实验：小鼠、果蝇等 系谱分析：人、多年生植物 DNA转移：不发生减数分裂的细菌等
Apr
PstI SalI BamHI Tcr
pHC79 6400 bp ori cos λfragment
片段装载范围为31 - 45 kb
二、 物理图谱（physical map）
1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线
质粒（plasmid）
多克隆位点
分子量小，拷贝数高 操作方便
polylinker
一、 遗传图谱（genetic map）
遗传图的偏离 造成遗传图偏离的原因
重组热点（recombination hot spot): 染色体上某些比其他位点有更高交换 频率的位点。 近端粒区和远着丝粒区有较高重组率。 性别之间也表现重组率的差异。 双交换的出现，产生距离减少的假象。
二、 物理图谱（physical map）
1.2 部分酶切法测定DNA片段位置
练习： 一线状DNA片段，分别经限制酶A完全酶切和不完全酶切 后，得到如下电泳图，请标出A在该DNA分子上的位置。
8
5
3 ＋ 2
5
2
完全
不完全
二、 物理图谱（physical map）
1.2 部分酶切法测定DNA片段位置
局限性： 随着DNA长度的增加和酶切位点的增多，单酶 切、双酶切及部分酶切产生的条带数成比例扩大， 需要对大量的片段进行比对和组装。虽可借助计 算机，但是难免会产生一些大小非常接近的片段， 导致电泳分辨困难。 限制性作图只能应用于较小的DNA分子，上限 约50kb
二、 物理图谱（physical map）
二、 物理图谱（physical map）
1、物理图作图方法
例一
一线状DNA分子经两种限制酶完全酶切后得如下结果： EcoRI HindIII 3kb、7kb ， EcoRI/HindIII 1、2、7kb 2kb 、8kb，将各限制酶位点绘制在DNA分子上。
之 限制性酶切作图
一线状DNA分子经两种限制酶完全酶切后得如下结果： EcoRI HindIII 分子上。 5kb ， EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb 1kb、3kb 、6kb，将各限制酶位点绘制在DNA
复制起始点
ori
Amp
筛选标记
片段装载范围数百bp到10 kb
二、 物理图谱（physical map）
1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线
重叠群的构建—染色体步移
二、 物理图谱（physical map）
1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线
重叠群的构建—克隆指纹排序 一个克隆的指纹表示该克隆所具有的序列特征， 可以同其他克隆产生的同类指纹相比较。 如果两个克隆的指纹有部分重叠，表明这两个 克隆具有共同的区段。 指纹的类型很多，可单独使用或组合使用，如 RFLP指纹，重复序列指纹，STS指纹等。
8 5 3 ＋ 5
2
2
YAC重 叠群 1000kb
cosmid 重叠群 40kb
质粒亚 克隆
限制酶作图、 测序分析
二、 物理图谱（physical map）
1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线
酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes, YAC）
YAC载体是利用酿酒酵母的染色体 CEN4 ARS1 的复制元件构建的载体。 EcoRI TRP1 YAC载体必须含有以下元件： ①端粒重复序列（TEL） Apr pYAC4 URA3 ②着丝粒（CEN） ③自主复制序列（ARS） ori
表型
ec + + sc + + + cv cv + cv
62+88 1980
实得数量
810 828 62 88 89 103
ec sc + + sc ec +
合计
1980
=7.6% ec ec ec 17.3 9.7 7.6 9.7 cv sc cv
ec-sc 的重组值：
ec-cv 的重组值：9.7
一、 遗传图谱（genetic map）
3、遗传作图的方法
有性杂交实验：小鼠、果蝇等
选择已知基因型的亲本，设计杂交方案，获得 交配的子代并分析其表型和基因型。
常用的方法：两点测交和三点测交。
测交：基因型杂合个体与有关隐性纯合个体之间的交配
杂合个体产生的各种配子所占比例可在子代表型所占比例上反映出来
二、 物理图谱（physical map）
2. 荧光原位杂交（FISH）作图
（Fluorescent in Situ Hybridization ）
将一组不同颜色的荧光标记探针与单个变 性的染色体杂交，分辨出每种杂交信号，从 而测定出各探针序列的相对位置。 探针间的位置关系提供了DNA序列与基因组 图谱间的直接联系。
非减数分裂分析
基因转移在具有野生型等位基因的供体品系与具 有隐性等位基因的受体品系之间进行，根据受体细 胞是否获得基因指令的生化功能来监测转移的DNA是 否进入受体细胞。
接合：根据野生型基因进入受体的时间表，可以 确定基因所在的位置。 转导及转化：依据所研究的基因是否同时出现在 受体细胞中，紧密连锁的基因总是有最高的机率被 同时转移。
遗传标记的排列有时会出现差错。
物理图的构建是基因组测序的基础，有承上启下的作用。
二、 物理图谱（physical map）
1、物理图作图方法
限制性酶切作图：根据重叠序列确定酶切片段 间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离。 荧光原位杂交（FISH）作图：将分子标记与完 整染色体杂交来确定标记的位置。 序列标记位点（STS）作图：通过对基因组片段 进行PCR和杂交分析，来对短序列进行定位作图。
二、 物理图谱（physical map）
1、物理图作图方法 之 限制性酶切作图
1.1 限制性酶切作图的原理 二 对DNA进行不完全酶切，产生部分重叠的片段。 可根据重叠顺序的相对位置将各个片段首尾连 接，构成连续顺序图。 以连续的重叠群为基本框架，通过遗传标记将 重叠群排列于染色体上。
二、 物理图谱（physical map）
基因组作图
应用界标或遗传标记对基因组进行精细的 划分，进而标示出DNA的碱基序列或基因排列 的工作。 主要有遗传图、物理图、序列图、基因图。
基因组作图的基本构想
在长链DNA分子的不同位置寻找特征性的遗 传标记，并将其定位在染色体的特定位置上， 绘制基因组图。
遗传标记
是DNA水平上绘制现代遗传图谱的主要路标 （landmark)。
1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线 染色体→酵母人工染色体（YAC）重叠群→
筛选阳性YAC酶切→ cosmid人工染色体重叠群
→阳性cosmid酶切→质粒亚克隆→限制酶作图
→计算机分析串联，获得大片段。
即：基于克隆的基因组作图
二、 物理图谱（physical map）
1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线
果 蝇 连 锁 图
一、 遗传图谱（genetic map）
4、遗传图谱的用途
提供基因在染色体上的坐标，为基因识别 和基因定位创造了条件。 例如，6000多个遗传标记能够把人的基 因组分成6000多个区域，连锁分析找到某一 疾病基因与某一标记紧密连锁的证据，可把 这一基因定位于这一已知区域。 遗传图的分子座标也是基因组物理图绘制 的基础。
sc-cv 的重组值：17.3
sc 7.6
一、 遗传图谱（genetic map）
3、遗传作图的方法 之
家系连锁分析
遗传标记系谱连锁分析图
“1”片段与疾病基因连锁
一、 遗传图谱（genetic map）
3、遗传作图的方法 之
非减数分裂分析
一、 遗传图谱（genetic map）
3、遗传作图的方法 之
二、 物理图谱（physical map）
1、物理图作图方法 之 限制性酶切作图
1.1 限制性酶切作图的原理 一
用一种限制酶处理，电泳分离大小确定的DNA片 段。
用第二种限制酶处理，获得第二组片段。 用两种酶混合处理，获得第三组片段。 对三组片段进行比对组装，对于两种酶切位点 交替出现的区段，利用加减法即可确定酶切位点 的相对位置。
二、 物理图谱（physical map）
2. 荧光原位杂交（FISH）作图
二、 物理图谱（physical map）