线粒体蛋白质组学研究进展(一)

线粒体蛋白质组学研究进展(一)
【关键词】蛋白质组
【关键词】线粒体；蛋白质组
0引言
线粒体拥有自己的DNA（mtDNA），可以进行转录、翻译和蛋白质合成.根据人类的基因图谱，估计大约有1000~2000种线粒体蛋白，大约有600多种已经被鉴定出来.线粒体蛋白质只有2%是线粒体自己合成的，98%的线粒体蛋白质是由细胞核编码、细胞质核糖体合成后运往线粒体的，线粒体是真核细胞非常重要的细胞器，在细胞的整个生命活动中起着非常关键的作用.线粒体的蛋白质参与机体许多生理、病理过程，如ATP的合成、脂肪酸代谢、三羧酸循环、电子传递和氧化磷酸化过程.线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关，如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症.尤其是在神经退行性疾病方面，线粒体蛋白质的研究日益受到关注.蛋白质组研究技术的产生与发展为线粒体蛋白质组的研究提供了有力的支持，使得从整体上研究线粒体蛋白质组在生理、病理过程中的变化成为可能.
1线粒体的结构、功能与人类疾病
线粒体一般呈粒状或杆状，也可呈环形、哑铃形或其他形状，其主要化学成分是蛋白质和脂类.线粒体由内外两层膜封闭，包括外膜、内膜、膜间隙和基质四个部分.线粒体在细胞内的分布一般是不均匀的，根据细胞代谢的需要，线粒体可在细胞质中运动、变形和分裂增殖.线粒体是细胞进行呼吸的主要场所，在细胞代谢旺盛的需能部位比较集中，其主要功能是进行氧化磷酸化，合成ATP，为细胞生命活动提供直接能量.催化三羧酸循环、氨基酸代谢、脂肪酸分解、电子传递、能量转换、DNA复制和RNA合成等过程所需要的一百多种酶和辅酶都分布在线粒体中.这些酶和辅酶的主要功能是参加三羧酸循环中的氧化反应、电子传递和能量转换.线粒体具有独立的遗传体系，能够进行DNA复制、转录和蛋白质翻译.线粒体不仅为细胞提供能量，而且还与细胞中氧自由基的生成、细胞凋亡、细胞的信号转导、细胞内离子的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控等有关.许多实验证实，线粒体功能改变与细胞凋亡〔1〕、衰老〔2〕、肿瘤〔3，4〕的发生密切相关；另外，有许多人类疾病的发生与线粒体功能缺陷相关，如线粒体肌病和脑肌病、线粒体眼病，老年性痴呆、帕金森病、2型糖尿病、心肌病及衰老等，有人统称为线粒体疾病〔5〕.
2线粒体蛋白质组学研究现状
2.1线粒体蛋白质组的蛋白质鉴定Rabilloud等〔6〕在1998年，以健康人的胎盘作为组织来源，分离提取线粒体进行蛋白质组研究，试图建立线粒体蛋白质组的数据库，为研究遗传性或获得性线粒体功能障碍时线粒体蛋白质的变化提供依据.他们使用IPG（pH4.0~8.0）双相电泳技术,共获得1500个蛋白点.通过MALDITOFMS和PMF等技术鉴定其中的一些蛋白点，鉴于当时基因组信息的局限性，只有46种蛋白被鉴定出来.随着人类基因组图谱的完成，应该有更多的蛋白点被鉴定出来.Fountoulakis等〔7〕从大鼠的肝脏中分离线粒体，并分别利用宽范围和窄范围pH梯度IPG对线粒体蛋白质进行双相电泳，通过MALDIMS鉴定出192个基因产物，大约70%的基因产物是具有广谱催化能力的酶，其中8个基因产物首次被检测到并且由一个点构成，而大多数蛋白质都是由多个点构成，平均10~15个点对应于一个基因产物.Mootha等〔8〕从小鼠大脑、心脏、肾脏、肝脏中分离提取线粒体蛋白质，进行线粒体蛋白质组研究，他们参照已有的基因信息共鉴定出591个线粒体蛋白质，其中新发现了163个蛋白质与线粒体有关.这些蛋白质的表达与RNA丰度的检测在很大程度上是一致的.不同组织的RNA表达图谱揭示出线粒体基因在功能、调节机制方面形成的网络.对这些蛋白与基因的整合分析使人们对哺乳动物生物起源的认识更加深入，对理解人类疾病也具有参考价值.2.2线粒体亚组分的研究线粒体对维持细胞的体内平衡起着关键作用，因此加速了人们对线粒体亚组分的研究.线粒体内膜不仅包含有呼吸链复合物，它还包含多种离子通道和转运
蛋白.对线粒体发挥正常的功能起着重要作用.Cruz等〔9〕专注于线粒体内膜蛋白质的研究，他们通过二维液相色谱串联质谱技术鉴定出182个蛋白质，pI（3.9~12.5），MW （Mr6000~527000），这些蛋白与许多生化过程相关，比如电子传递、蛋白质运输、蛋白质合成、脂类代谢和离子运输.2.3线粒体蛋白质复合物的研究线粒体内膜上嵌有很多蛋白质复合物，对于线粒体的功能具有重要作用，应用常规的双相电泳很难将这些蛋白质复合物完整地分离出来.Devreese等〔10〕采用Bluenativepolyacrylamidegelelectrophoresis（BNPAGE）分离线粒体内膜上的五个氧化磷酸化复合物，结合肽质量指纹图谱，成功地鉴定出氧化磷酸化复合物中60%的已知蛋白质.BNPAGE在分离蛋白质复合物时可以保持它们的完整性，因此这项技术可以用于研究在不同的生理病理状态下蛋白质复合物的变化及临床诊断等.2.4线粒体蛋白质组数据库目前人们查询最多的线粒体蛋白质组数据库有MITOP,MitoP2和SWISSPROT三种.MITOP〔11〕是有关线粒体、核编码的基因和相应的线粒体蛋白质的综合性数据库，收录了1150种线粒体相关的基因和对应的蛋白质，人们可依据基因、蛋白质、同源性、通道与代谢、人类疾病分类查询相关的信息.MitoP2〔12〕数据库中主要为核编码的线粒体蛋白质组的数据，MitoP2数据库将不同来源的线粒体蛋白质的信息整合在一起，人们可以根据不同的参数进行查询.MitoP2数据库既包括最新的数据也包括最初的MITOP〔11〕数据库中的数据.目前数据库中主要为酵母和人的线粒体蛋白质组的数据，以后还将收录小鼠、线虫等的数据.数据库旨在为人们提供线粒体蛋白质的综合性数据.SWISSPROT数据库包含269种人类线粒体蛋白质，其中与人类疾病相关的蛋白质有225种.数据库中有相当一部分蛋白质没有明确的定位和功能信息的描述.随着线粒体研究热潮到来和蛋白质组学技术的发展，将有更多的数据被填充到数据库中.
3线粒体蛋白质组研究中存在的问题
3.1线粒体碱性蛋白质与低分子量蛋白质线粒体蛋白质中，具有碱性等电点的蛋白质占有很大比例，在等电聚焦时难以溶解，一些碱性程度很大的蛋白质如细胞色素C（pH10.3）在pH3~10的IPG胶上不能被分离出.线粒体蛋白质中相当一部分蛋白是低分子量蛋白，因此在SDSPAGE电泳时要分别应用高浓度和低浓度分离胶，以更好地分离低分子量蛋白质和高分子量蛋白质.3.2线粒体膜蛋白质线粒体是一个具有双层膜结构的细胞器，内膜和外膜上整和有很多膜蛋白质，这些膜蛋白质对于线粒体功能的发挥具有重要作用，但是膜蛋白质具有很强的疏水性，在等电聚焦时，用常规的水化液难以溶解，因此用常规的IPG胶检测不出来.换用不同的裂解液对膜蛋白的溶解具有帮助.有研究人员在等电聚焦缓冲液中加入SB310以增加膜蛋白的溶解性.在等电聚焦前对样品进行有机酸处理也可以增加膜蛋白的溶解性.在研究中人们发现,不同的样品应该选用不同的裂解液，没有一种裂解液能够适合于所有的膜蛋白质.。