植物抗寒性测定

（三）过氧化氢酶（CAT）活性的测定 低温胁迫下，细胞内易产生H2O2破坏膜系统的稳定，而过氧化氢酶（CAT）能把H2O2分 解为H2O和O2，从而清除H2O2维护膜的稳定性。研究表明，抗寒性强的品种有较高的过氧化 氢酶活性，且随温度下降，以抗寒性强的品种下降幅度小，与抗寒性呈显著性相关。
CAT酶活性大小可用一定时间内分解的H2O2量来表示。在反应系统中加入一定量（反应 过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2， 即可求出被CAT分解的H2O2量：
田间鉴定能最直接的反映不同品种在同一条件下的抗寒性差异。该法直接、简单，可进 行大范围、大群体的评价，但受地域、品种数量的限制，只能比较少数几个同一地段的品种 之间的抗寒力差异，不能对他们的抗寒能力进行量化。
2．实验室间接鉴定 实验室间接鉴定，就是根据作物某些生理生化指标及物理指标间 接推断供试材料的抗寒性。
再加入 2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计算时间，于 30℃恒温水浴中反应 10min，立即加入
10%H2SO4 2.5ml。然后用 0.1mol/L KMnO4滴定，至出现粉红色（30min内不消失）为终点。 4．结果计算
酶活性用每克鲜重样品在 10min内分解H2O2毫克数表示。
(A − B)×V
实验 16 植物抗寒性鉴定
我国植物种类繁多，分布区域广，在晚秋和早春时期发生的冻害和冷害两种低温危害， 常常给越冬作物和果木造成严重伤害。冻害由 0℃以下低温造成，冷害由 0℃以上低温引起， 冷害对植物的伤害程度，除取决于低温外，还取决于低温维持时间的长短。植物抗寒性的强 弱决定其生长季节，因此蔬菜作物利用抗寒品种，可以将露地栽培提前，提早供应市场；而 选育抗寒性强的果树品种，不仅是寒带果树育种者的主攻方向，而且也是温带甚至热带果树 育种者重要育种目标之一。
5H2O2＋2KMnO4＋4H2SO4 → 5O2＋2KHSO4＋8H2O＋2MnSO4
1．试剂配制 10%H2SO4；0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH＝7.8）； 0.1mol/L 高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.160g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成 1000ml，用 0.1mol/L草酸标定； 0.1mol/L H2O2：取 30%H2O2溶液 5.68ml，稀释至 1000ml，用标准 0.1mol/L KMnO4溶液 在酸性条件下标定。
电解质渗出率（%）＝
浸泡液电导率值 煮沸后电导率值
×
100％
伤害度（%）＝
处理电导率值T1－对照电导率值C1 处理煮沸后电导率值T2－对照煮沸后电导率值C2
×100%
2．绝对电解质渗出量的测定 有时为了求得电解质的绝对渗出量，需要用分析纯的 KCl 配成不同浓度的标准液（0.01 －10mmol/L），在 25℃下测定其电导率值，并绘制电导率（μS/cm）—浓度（mg/ml）标准 曲线。由标准曲线查知样品的外渗电导率值相当于 KCl 的浓度，再折算每克材料的绝对外 渗量（mg/g），即 绝对电解质渗出量（mg/g），即 绝对电解质渗出量（mg/g）＝A×B/W 式中，A—根据样品电导率值，从标准曲线中查出的与 KCl 相当浓度（mg/ml）；
（3）温度对溶液电导影响很大，故S1与S2必须在相同温度下测定。 （二）超氧物歧化酶（SOD）测定 超氧物歧化酶（SOD）是一种清除超氧阴离子自由基的酶，普遍存在于植物体内。本实 验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可氧 化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴 离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲月朁 ，后者在 560nm 处有最 大吸收。而 SOD 可清除超氧阴离子自由基从而抑制了甲月朁 的形成。于是光还原反应后， 反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 1．试剂配制 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称 1.9399g Met 用磷酸缓冲液定容至 100ml。 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT）溶液：称取 0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至 100ml 避 光保存。 100μmol/L EDTA-Na2溶液：称取 0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至 1000ml。 20μmol/L 核黄素溶液：称取 0.00753g 核黄素定容至 1000ml 避光保存。 2．酶液提取 称取处理和对照样品各 0.5g，加入 5ml 磷酸缓冲液，冰浴研磨提取，然后 15000rpm 离 心 10min，所提上清液为酶液。 3．显色反应 3ml反应液为 0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5ml，750umol.L-1NBT溶液、130mmol/L甲硫氨酸 （MET）溶液、100umol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）液、20umol/L核黄素各 0.3ml， 蒸馏水 0.25ml和 0.05ml酶提取液（对照管加蒸馏水）。混匀后将１支对照管置暗处，其它各 管于 4000lx日光灯下反应 20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时间延长）。 4．SOD 活性测定与计算 反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的光吸收，已知 SOD 活性 单位以抑制 NBT 光化还原的 50%为一个酶活性单位表示，按下式计算 SOD 活性。
SOD 总活性＝ ( ACK − AE ) ×V
ACK
×
1 2
×W
× Vt
SOD
比活力＝
SOD 总活性 蛋白质浓度
式中：SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg 蛋白表示；
ACK—照光对照管的光吸收值； AE—样品管的光吸收值； V—样液总体积（cm3）； Vt—测定时样品用量（cm3）； W－样重（g）； 蛋白质浓度单位为：mg 蛋白/g 样重。 研究表明，当遭受低温胁迫时，引起 SOD 活性的下降，下降的百分率与品种抗冷性呈 负相关，故能反应品种间抗冷能力的高低。
B—浸泡液的体积（ml）； W—样品鲜重（g）。 2．注意事项 （1）在电导测定中一般应用去离子水，若制备困难可用普通蒸馏水代替，但在测定中 设一空白试管，测定样品时要同时测定其空白电导值，按下式计算相对电导度：
相对电导度（L）＝
S1 − 空白电导值
S
－空白电பைடு நூலகம்值
2
（2）CO2在水中的溶解度较高，在测定电导时要防止高CO2气源和口中呼出的CO2进入 试管，以免影响结果的稳定性。
本实验重点学习实验室间接鉴定果树抗寒性的方法和步骤。
一、试材及用具
1．试材及处理：植物枝条或花朵，将采回的枝条剪成 40cm 左右的长度，用自来水冲 洗数遍（洗掉泥土、灰尘、虫卵），再用蒸馏水冲洗三次，然后用吸水纸吸干水分，最后将 枝条末端进行蜡封。将每个品种蜡封后的枝条分成相等的 6 份，其中一份作为对照，其余每 份作为一个低温处理，放于冰箱中（0℃～4℃）保存备用。每次处理时，各取参试品种的一 份枝条放于超低温冰箱或程控冰箱内进行低温处理，处理温度梯度为：CK（0℃），-20℃， -25℃，-30℃，-35℃，-40℃。降温速度为 4℃/h，达到目的处理温度后维持 12h，然后逐步 升温，升温速度亦为 4℃/h。花朵的处理温度梯度为：CK（0℃），-1℃，-3℃，-5℃，-6℃， -7℃，-8℃。
2．酶液提取 取剪碎的样品 2.5g 加入磷酸缓冲液（pH7.8）少量，研磨成匀浆，转移到 25ml 容量瓶 中，将研钵冲洗干净，冲洗液转至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000×g 离心 10min， 上清液为酶粗提液。
3．酶液滴定
取 50ml三角瓶 4 个（两个测定，两个对照），测定加入酶液 2.5ml，对照为煮死酶液 2.5ml；
在过氧化物酶催化下，过氧化氢分解成水和原子氧，原子氧能氧化联苯胺产生一种蓝色 的化学物质，该蓝色化合物在波长 580nm 处有一最大吸收峰。蓝色物质的生成速度（dx/dt） 与反应系统中过氧化氢分解速率呈正相关。因此，用分光光度计测出蓝色物质密度的变化（单 位时间内反应液中光密度的变化），可以表示过氧化物酶的活性。
2．仪器 烘箱，发芽箱，培养皿，标牌，电导仪，具塞刻度试管（20ml），恒温水浴锅， 温度计，玻璃棒，天平，研钵，石英砂，高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光 灯（4000lx），容量瓶（250ml、25ml），聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳槽，刻度吸管（10ml、 5ml），离心管等。
二、内容说明
常用差示温度分析来测量深过冷。以 DTA 法测定，一般植物在零下几度即散热结冰， 称为高温散热。经过低温锻炼的抗寒木本植物，在连续降温过程中，可见到有多次散热，第 一次在零下几度，主要是细胞外结冰，最后一次散热可达-20～-45℃的低温以下，叫低温散 热。在低温散热前一霎那的温度，即深过冷温度，用 LTE 温度表示。深过冷低温散热时， 可出现细胞内结冰而使组织死亡。日本京都大学 S.K.Kang（1998）等对苹果、桃、梨、柿 子和葡萄 5 种落叶果树通过温度分析测定了两种散热 HTE 和 LTE，发现柿子与葡萄仅有 LTE，所有树种的低温散热温度与花芽的半致死温度一致。
植物的抗寒性鉴定可分为田间鉴定和实验室间接鉴定两种方法。 1．田间鉴定 田间自然鉴定就是在冻害发生期（早春及晚秋）对受冻的田间植株一定 器官、组织以一定的标准进行评价、比较，然后根据冻害情况评价抗寒性。 陈学森等（2001）对山东省春季“倒春寒”发生后，受害的核果类果树的花器官的抗寒 性进行了调查，选出了当地花期抗寒性较强的红荷包、红丰等杏品种，证明种间的抗寒力大 小顺序是：桃﹥杏﹥李﹥大樱桃。 赵玉田（1993）对不同生态型玉米的抗寒性进行了田间鉴定，测定的项目包括３个抗冷 指标：
生理生化指标主要包括超氧物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD） 活性测定及同工酶分析、丙二醛（MDA）及可溶性糖含量等方法。
三、方法步骤
（一）质膜透性测定－电导法 近年来的研究表明，在低温伤害尤其冷害中，膜系统常常是最先受到伤害的部位，寒害 能使脂膜受损伤，透性加大，细胞内离子（主要是K＋离子）外渗量增多，电导率加大。因 此可以用电导仪测定溶液的电导率，求算电解质渗出率（或称伤害率）。伤害率愈高则愈不 抗寒，反之则愈抗寒。 1．电解质渗出率的测定 取处理和对照样品各 0.5g，放入试管中，加 10ml 去离子水，置 25℃下 10h。用玻璃棒 搅拌均匀，然后用电导仪测电导值分别为 T1 和 C1。再将试管放入沸水中 10min，待其冷却 至 25℃时，测得处理和对照得电导值为 T2 和 C2，按下式计算电解质渗出率和伤害度：
相对出苗率（%）（RER）：
RER＝
第一期出苗率 第二期出苗率
× 100％
出苗指数（EI）：
EI＝
∑
[(某日出苗数)× (播后天数)]
出苗总数（30d）
幼苗干物重（SDW），取地上部三叶期 10 株幼苗，烘至恒重。 三个抗冷特性以总指数值（TIV）表示，即占各自等级顺序之和。其值反应了低温下种 子出苗生长和干物质积累能力。
酶活性（mgH2O2/g F W）＝
a ×1.7 W
A－对照KMnO4滴定ml数； B－酶反应后KMnO4滴定ml数； V－酶提取液总量（ml）； a－反应所用酶液量（ml）； W－样重（g）。 5．注意事项 所用KMnO4溶液及H2O2溶液使用前要经过标定，0.1mol/L H2O2要新配制。 （四）过氧化物酶（POD）活性测定及同工酶分析 1．过氧化物酶（POD）活性测定
物理指标 Lyons 和 Raison（1970）证明植物低温发生时，生物膜首先发生膜脂的物相变 化，膜的外形和厚度发生变化，膜上产生龟裂，因而膜的透性增大，电解质大量外渗。抗寒 性强的品种细胞膜透性增大程度轻，抗寒性差的品种与之相反。因此，测量电解质外渗量变 化可以比较植物的抗寒性。在黑穗醋栗、梨、猕猴桃（Shaoli Lu，1990）等许多种果树的不 同器官，如花、枝、叶等都有相似结论。另外，通过电导率值配以 Logistic 方程，可以求出 半致死温度，确定植物的临界致死温度。