Lys代谢控制发酵
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HseHse-抗Lys反馈抑制 基本培养基＋Hse(高浓度)＋ AEC(Lys结构类似物)
Hse-, AECr：解除Lys对Asp激酶反馈抑制的Hse营养缺陷型 双突变株，不论添加Hse浓度高低，皆不会出现Thr+Lys协 同反馈抑制，大量积累Lys第7页/共19页
(3) Hse脱氢酶渗漏缺陷型突变株
Glc
CO2 AC-coA
丙酮酸 羧化酶
CO2 草酰乙酸
天门冬氨酸 （Asp）
合成酶 柠檬酸
反
反
顺乌头酸
馈
馈
抑
阻 遏
异柠檬酸
制
α-酮戊二酸 脱氢酶
α-酮戊二酸 谷氨酸Байду номын сангаас脱氢酶
Glu
第1页/共19页
二、生物素对代谢的调控作用
• Glu产生菌主要生理生化特性
需氧，生物素缺陷型bio-,有乙醛酸循环， 羧化酶活性强（bio作为辅酶）
柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性 高，Glu合成中存在正常反馈阻遏和反馈抑 制。菌体细胞膜通透性差，不利于Glu胞外 分泌。
第2页/共19页
生物素对CO2固定反应的影响 生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定
反应，据报道，生物素大过量时（100g/L以 上），CO2固定反应可提高30%。
Hse-, AECr：解除Lys对Asp激酶反馈抑制的Hse营养缺陷型 双突变株，不论添加Hse浓度高低，皆不会出现Thr+Lys协 同反馈抑制，大量积累Lys第11页/共19页
(3) Hse脱氢酶渗漏缺陷型突变株
亚硝基胍
日本椎尾等人 黄色短杆菌
突变株
• Hse脱氢酶活性仅为 野生型菌株的1/30 • Met，Thr合成量很少，仅满足菌体生长 • 代谢流转向Lys大量合成 • Thr合成量少，和Lys形不成协同反馈抑制，
亚硝基胍
日本椎尾等人 黄色短杆菌
突变株
• Hse脱氢酶活性仅为 野生型菌株的1/30 • Met，Thr合成量很少，仅满足菌体生长 • 代谢流转向Lys大量合成 • Thr合成量少，和Lys形不成协同反馈抑制，
大量积累Lys，产量达25g/L
第8页/共19页
(4) Lys 生产菌种遗传标记及Lys产量
遏
第6页/共19页
3. Lys 代谢控制发酵
菌种的遗传改造
(1)切断支路代谢——Hse营养缺陷型(Hse-)菌 株筛选
选育Hse脱氢酶缺失的Hse-菌株，使代谢 流向Lys合成，控制Hse添加量，既满足菌 体对Met、Thr和Ile生长需要又不形Thr和 Lys对Asp激酶的协同反馈抑制，积累Lys (2)用诱H变 seH-s菌e-Ly株s反选馈抑育制解除Lys反馈抑制(H长s突e出-,菌A变E落C株r)
黄色短杆菌 AIII Hse-AECr 徐所维
50-
55g/L
第13页/共19页
(5) 乳糖发酵短杆菌Lys代谢控制发酵 Lys合成与调控机制基本同于谷氨酸棒杆菌、
黄色短杆菌。
特殊调控：代谢互锁调控机制
互锁调节：Lys合成受其它氨基酸合成途径 产物反馈调节
Lys生产菌种遗传标记和产量：
Hse－AECRLeu－
黄色短杆菌。
特殊调控：代谢互锁调控机制
互锁调节：Lys合成受其它氨基酸合成途径 产物反馈调节
Lys生产菌种遗传标记和产量：
Hse－AECRLeu－
110g/L
（加Hse，限量加Leu，免除Leu对DDP合成酶反馈阻遏互锁调节）
第10页/共19页
3. Lys 代谢控制发酵
菌种的遗传改造
(1)切断支路代谢——Hse营养缺陷型(Hse-)菌 株筛选
第3页/共19页
第五节 Lys代谢控制发酵
1. 生产菌种 谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum） 黄色短杆菌(B. flavum) 乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)
2、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌Lys合成途径 及正常调控机制
第4页/共19页
Asp 天冬氨酸 Asp 激酶
天冬氨酸-P
1、营养缺陷型补充营养检测法 His产生菌
鉴定生长区
影印接种
大量UV照射 细胞死亡
丰富细菌 培养基平板分离
产氨基酸培养基
天冬氨酸-β –半醛
Hse脱氢酶
DDP合成酶
合成酶 高丝氨酸
二氢吡啶-2,6-二羧酸
O-琥珀酰-高丝氨酸 高丝氨酸-P
蛋氨酸 (Met)
苏氨酸
赖氨酸(Lys)
（Thr）
Thr脱氢酶
异亮氨酸（Ile）
第5页/共19页
(1) Asp三分支途径优先合成Met，后合成Thr、 Ile，最后合成Lys
(2) Thr和Lys对Asp激酶有协同反馈抑制 (3) Thr对Hse脱氢酶有反馈抑制 (4) Ile对Thr脱氢酶有反馈抑制 (5) Met对O-琥珀酰高丝氨酸合成酶有反馈阻
110g/L
（加Hse，限量加Leu，免除Leu对DDP合成酶反馈阻遏互锁调节）
第14页/共19页
Asp Asp激酶
Asp-P
协
Asp-β –半醛 DDP合成酶
反馈阻遏 Leu
同
反
Hse
馈
DDP DDP还原酶
反馈抑制 Ala
抑
制
Met
Thr
Lys
Ile
第15页/共19页
第六节 产氨基酸菌种的分离、检测原理 与方法
大量积累Lys，产量达25g/L
第12页/共19页
(4) Lys 生产菌种遗传标记及Lys产量
谷氨酸棒杆菌
Hse－ Hse－AECR
42g/L
K.Nakyama
13g/L
中山清（日本）
黄色短杆菌 Hse－AECRCSIFps I.shiio 51g/L
(CSI:柠檬酸合成酶抑制；Fps：氟代丙酮酸敏感)
选育Hse脱氢酶缺失的Hse-菌株，使代谢 流向Lys合成，控制Hse添加量，既满足菌 体对Met、Thr和Ile生长需要又不形Thr和 Lys对Asp激酶的协同反馈抑制，积累Lys (2)用诱H变 seH-s菌e-Ly株s反选馈抑育制解除Lys反馈抑制(H长s突e出-,菌A变E落C株r)
HseHse-抗Lys反馈抑制 基本培养基＋Hse(高浓度)＋ AEC(Lys结构类似物)
谷氨酸棒杆菌
Hse－ Hse－AECR
42g/L
K.Nakyama
13g/L
中山清（日本）
黄色短杆菌 Hse－AECRCSIFps I.shiio 51g/L
(CSI:柠檬酸合成酶抑制；Fps：氟代丙酮酸敏感)
黄色短杆菌 AIII Hse-AECr 徐所维
50-
55g/L
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(5) 乳糖发酵短杆菌Lys代谢控制发酵 Lys合成与调控机制基本同于谷氨酸棒杆菌、
Hse-, AECr：解除Lys对Asp激酶反馈抑制的Hse营养缺陷型 双突变株，不论添加Hse浓度高低，皆不会出现Thr+Lys协 同反馈抑制，大量积累Lys第7页/共19页
(3) Hse脱氢酶渗漏缺陷型突变株
Glc
CO2 AC-coA
丙酮酸 羧化酶
CO2 草酰乙酸
天门冬氨酸 （Asp）
合成酶 柠檬酸
反
反
顺乌头酸
馈
馈
抑
阻 遏
异柠檬酸
制
α-酮戊二酸 脱氢酶
α-酮戊二酸 谷氨酸Байду номын сангаас脱氢酶
Glu
第1页/共19页
二、生物素对代谢的调控作用
• Glu产生菌主要生理生化特性
需氧，生物素缺陷型bio-,有乙醛酸循环， 羧化酶活性强（bio作为辅酶）
柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酸脱氢酶活性 高，Glu合成中存在正常反馈阻遏和反馈抑 制。菌体细胞膜通透性差，不利于Glu胞外 分泌。
第2页/共19页
生物素对CO2固定反应的影响 生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2固定
反应，据报道，生物素大过量时（100g/L以 上），CO2固定反应可提高30%。
Hse-, AECr：解除Lys对Asp激酶反馈抑制的Hse营养缺陷型 双突变株，不论添加Hse浓度高低，皆不会出现Thr+Lys协 同反馈抑制，大量积累Lys第11页/共19页
(3) Hse脱氢酶渗漏缺陷型突变株
亚硝基胍
日本椎尾等人 黄色短杆菌
突变株
• Hse脱氢酶活性仅为 野生型菌株的1/30 • Met，Thr合成量很少，仅满足菌体生长 • 代谢流转向Lys大量合成 • Thr合成量少，和Lys形不成协同反馈抑制，
亚硝基胍
日本椎尾等人 黄色短杆菌
突变株
• Hse脱氢酶活性仅为 野生型菌株的1/30 • Met，Thr合成量很少，仅满足菌体生长 • 代谢流转向Lys大量合成 • Thr合成量少，和Lys形不成协同反馈抑制，
大量积累Lys，产量达25g/L
第8页/共19页
(4) Lys 生产菌种遗传标记及Lys产量
遏
第6页/共19页
3. Lys 代谢控制发酵
菌种的遗传改造
(1)切断支路代谢——Hse营养缺陷型(Hse-)菌 株筛选
选育Hse脱氢酶缺失的Hse-菌株，使代谢 流向Lys合成，控制Hse添加量，既满足菌 体对Met、Thr和Ile生长需要又不形Thr和 Lys对Asp激酶的协同反馈抑制，积累Lys (2)用诱H变 seH-s菌e-Ly株s反选馈抑育制解除Lys反馈抑制(H长s突e出-,菌A变E落C株r)
黄色短杆菌 AIII Hse-AECr 徐所维
50-
55g/L
第13页/共19页
(5) 乳糖发酵短杆菌Lys代谢控制发酵 Lys合成与调控机制基本同于谷氨酸棒杆菌、
黄色短杆菌。
特殊调控：代谢互锁调控机制
互锁调节：Lys合成受其它氨基酸合成途径 产物反馈调节
Lys生产菌种遗传标记和产量：
Hse－AECRLeu－
黄色短杆菌。
特殊调控：代谢互锁调控机制
互锁调节：Lys合成受其它氨基酸合成途径 产物反馈调节
Lys生产菌种遗传标记和产量：
Hse－AECRLeu－
110g/L
（加Hse，限量加Leu，免除Leu对DDP合成酶反馈阻遏互锁调节）
第10页/共19页
3. Lys 代谢控制发酵
菌种的遗传改造
(1)切断支路代谢——Hse营养缺陷型(Hse-)菌 株筛选
第3页/共19页
第五节 Lys代谢控制发酵
1. 生产菌种 谷氨酸棒杆菌（C.glutamicum） 黄色短杆菌(B. flavum) 乳糖发酵短杆菌(B.lactofermentum)
2、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌Lys合成途径 及正常调控机制
第4页/共19页
Asp 天冬氨酸 Asp 激酶
天冬氨酸-P
1、营养缺陷型补充营养检测法 His产生菌
鉴定生长区
影印接种
大量UV照射 细胞死亡
丰富细菌 培养基平板分离
产氨基酸培养基
天冬氨酸-β –半醛
Hse脱氢酶
DDP合成酶
合成酶 高丝氨酸
二氢吡啶-2,6-二羧酸
O-琥珀酰-高丝氨酸 高丝氨酸-P
蛋氨酸 (Met)
苏氨酸
赖氨酸(Lys)
（Thr）
Thr脱氢酶
异亮氨酸（Ile）
第5页/共19页
(1) Asp三分支途径优先合成Met，后合成Thr、 Ile，最后合成Lys
(2) Thr和Lys对Asp激酶有协同反馈抑制 (3) Thr对Hse脱氢酶有反馈抑制 (4) Ile对Thr脱氢酶有反馈抑制 (5) Met对O-琥珀酰高丝氨酸合成酶有反馈阻
110g/L
（加Hse，限量加Leu，免除Leu对DDP合成酶反馈阻遏互锁调节）
第14页/共19页
Asp Asp激酶
Asp-P
协
Asp-β –半醛 DDP合成酶
反馈阻遏 Leu
同
反
Hse
馈
DDP DDP还原酶
反馈抑制 Ala
抑
制
Met
Thr
Lys
Ile
第15页/共19页
第六节 产氨基酸菌种的分离、检测原理 与方法
大量积累Lys，产量达25g/L
第12页/共19页
(4) Lys 生产菌种遗传标记及Lys产量
谷氨酸棒杆菌
Hse－ Hse－AECR
42g/L
K.Nakyama
13g/L
中山清（日本）
黄色短杆菌 Hse－AECRCSIFps I.shiio 51g/L
(CSI:柠檬酸合成酶抑制；Fps：氟代丙酮酸敏感)
选育Hse脱氢酶缺失的Hse-菌株，使代谢 流向Lys合成，控制Hse添加量，既满足菌 体对Met、Thr和Ile生长需要又不形Thr和 Lys对Asp激酶的协同反馈抑制，积累Lys (2)用诱H变 seH-s菌e-Ly株s反选馈抑育制解除Lys反馈抑制(H长s突e出-,菌A变E落C株r)
HseHse-抗Lys反馈抑制 基本培养基＋Hse(高浓度)＋ AEC(Lys结构类似物)
谷氨酸棒杆菌
Hse－ Hse－AECR
42g/L
K.Nakyama
13g/L
中山清（日本）
黄色短杆菌 Hse－AECRCSIFps I.shiio 51g/L
(CSI:柠檬酸合成酶抑制；Fps：氟代丙酮酸敏感)
黄色短杆菌 AIII Hse-AECr 徐所维
50-
55g/L
第9页/共19页
(5) 乳糖发酵短杆菌Lys代谢控制发酵 Lys合成与调控机制基本同于谷氨酸棒杆菌、